| Comunicación Nº: 056 | English version  |
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Marco Masseroli, Francisco O'Valle, Trinidad Caballero,
Alejandro Pérez Milena, Raimundo M.G. Del Moral,
Raimundo G. Del Moral.
[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Iconografía] [Discusión] [Bibliografía]
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Para cuantificar automáticamente las áreas de fibrosis lobulillar y porto-periportal y septal y la morfología del área porto-periportal en secciones histológicas hepáticas, desarrollamos varios algoritmos de procesamiento de imagen que han sido reunidos en una aplicación de análisis de imagen, llamada Fibrosis HR. Sus componentes principales se muestran en Figura 1. Después de un paso preliminar en el que se inicializa el sistema, se carga la escala geométrica y se definen las condiciones de adquisición y medición de imagen, el programa se desarrolla en tres partes distintas: 1) adquisición y preelaboración de la imagen digital, 2) procesamiento de la imagen preelaborada, 3) análisis de la imagen procesada y medición de parámetros.
Imágenes histológicas de biopsias hepáticas teñidas con rojo Sirio se digitalizaron en blanco y negro con una resolución de intensidad luminosa de 8 bits (256 niveles de gris) y con un aumento global de 200X. El tamaño de la imagen óptica fue de 44221.34 µm² para una imagen de 256x256 pixeles cuadrados, lo que resultó en una resolución óptica de 0.67 µm² / pixel. Las imágenes analógicas se adquirieron usando un filtro óptico verde IF 550 y con una intensidad de iluminación un poco superior a la usada para la observación normal. Esto produjo imágenes con exceso de luz y redujo la influencia en la imagen digital de los elementos no específicamente teñidos por el rojo Sirio y no de interés para la evaluación (citoplasma y núcleos de los hepatocitos, que captan el contraste de tinción debido al ácido pícrico, como expuesto en Material Histológico), sin modificar las áreas de fibrosis teñidas (Fig. 2 A). Este procedimiento permite obtener un mejor resultado en la subsecuente segmentación automática de las áreas de fibrosis.
Para corregir la variabilidad potencial en la intensidad de tinción de secciones de tejido de diferentes lotes de tinción, se fijaron todos los parámetros de adquisición de imagen y la intensidad de iluminación de captura fue calibrada por el usuario sólo ajustando la abertura del condensador del microscopio. Para optimizar la definición y reproducibilidad de los valores de intensidad de iluminación de captura, se desarrolló una función de control de captura de imagen. Esta función le muestra al usuario la imagen digital captada y también su sobreposición con el resultado de su umbralización automática, sucesivamente comentada en Procesamiento de Imagen.
Para evitar interferencias causadas por iluminaciones irregulares o aberraciones de la lente de la cámara, se realizó un "shading correction" de la imagen digital y se normalizó la misma mediante su comparación pixel por pixel con una imagen de fondo previamente captada con las mismas condiciones de enfoque e iluminación en una parte limpia y sin tejido del mismo cristal. La normalización de la imagen fue asegurada expandiendo el histograma de los niveles de gris de la imagen a todo el rango de niveles disponibles 17.
La identificación de los elementos de interés en la imagen se realizó mediante una sucesión de algoritmos de procesamiento de imagen que incluyeron umbralización automática de los niveles de gris de la imagen, operaciones lógicas y transformaciones de morfología matemática.
El proceso de preelaboración proporciona imágenes con características homogéneas, independientemente de sus condiciones de digitalización. Esto hace posible aplicar técnicas del umbralización automática a las áreas específicamente teñidas por el rojo Sirio. La segmentación automática se realizó usando el método global de umbralización definido por Kurita et al. 18. En imágenes de tejido hepático teñido con rojo Sirio, captadas con exceso de luz y preelaboradas como previamente descrito, esta segmentación proporciona una imagen binaria que representa la matriz extracelular portal, periportal y lobulillar del intersticio hepático, compuesta de diferentes tipos de colágenas y proteínas no fibrilares. Esta representa las diferentes áreas de fibrosis en la imagen, que son sucesivamente extraídas y clasificadas en relación a la región de la imagen en donde se encuentran (Figs. 2 B y C).
Las zonas de aglomeración de fibrosis se consideran para extraer el área porto-periportal en la imagen. Inicialmente, la imagen binaria de las áreas específicamente teñidas por el rojo Sirio y previamente umbralizadas, se procesa automáticamente con una sucesión de transformaciones de morfología matemática que extraen todas las posibles regiones de interés en la imagen 19, 20. Sucesivamente, el área porto-periportal se identifica interactivamente entre las regiones extraídas, simplemente trazando sobre ella una línea poligonal (Fig. 2 D). A veces, especialmente en imágenes histológicas de biopsias hepáticas patológicas, cuando los límites externos de la región porto-periportal no son bien definidos, el contorno del área automáticamente extraída puede no coincidir exactamente con el perímetro de la región porto-periportal. En tales casos se puede usar la misma polilínea para corregir el contorno de las áreas identificadas. Finalmente, un algoritmo automático de operaciones lógicas y de morfología matemática considera la polilínea trazada para extraer la región porto-periportal real en la imagen.
Las luces vasculares y de los conductos biliares de área mayor de 160 µm² y localizadas dentro de la región portal, son automáticamente segmentadas a través de umbralización automática, filtraje espacial y operaciones lógicas. La umbralización automática se realiza aplicando el método global de Kittler e Illingworth 21 a las áreas claras de la imagen, que complementan las regiones teñidas específicamente por el rojo Sirio y previamente segmentadas con la umbralización de Kurita. La umbralización automática de Kittler e Illingworth realizada en esta manera segmenta las áreas de la imagen muy ligeramente o completamente no teñidas. De estas, las áreas dentro de la región portal y con superficie mayor de 160 µm², que corresponden a las luces vasculares y de los conductos biliares más relevantes dentro del área portal, son automáticamente aisladas por filtraje espacial y operaciones lógicas (Fig. 2 E).
En el caso de que zonas de ruptura del tejido se incluyan en la imagen, éstas presentan las mismas características densitométricas y dimensionales de las luces vasculares y de los conductos biliares. Por lo tanto, para evitar considerar estas zonas como luces, las áreas automáticamente segmentadas son interactivamente identificadas trazando encima de ellas una línea poligonal. Además, cuando dentro de las luces vasculares están presentes células hemáticas o material proteico, sus áreas pueden no ser extraídas automáticamente o resultar parcialmente incorrectas. En tales casos las áreas de las luces pueden ser interactivamente segmentadas o parcialmente corregidas usando la misma polilínea, como previamente descrito en el apartado Extracción del Área Porto-Periportal.
En esta sección todos los elementos de interés de la imagen, aislados y clasificados durante el procesamiento de la imagen, son medidos automáticamente y mostrados sobrepuestos a la imagen inicial preelaborada para que se pueda evaluar inmediatamente la precisión de la segmentación (Fig. 2). Así, las áreas de fibrosis lobulillar (FL), las áreas de fibrosis porto-periportal y septal (FP), el área porto-periportal (AP), y las áreas de las luces vasculares y de los conductos biliares dentro de la región portal (AL) se cuantifican en µm². Además, los porcentajes de estas áreas se calculan como sigue:
Todos los datos se archivan en ficheros ASCII de datos, donde cada línea se refiere a una imagen evaluada y contiene el nombre de la imagen y los valores de todos sus parámetros cuantificados. Esta organización facilita el manejo de los datos y su exportación a cualquier programa externo para ulteriores evaluaciones estadísticas. Además, por cada biopsia evaluada se genera automáticamente un fichero de informe. Este fichero contiene las medias aritméticas de cada parámetro cuantificado en todas las imágenes evaluadas.
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