| Comunicación Nº: 087 | English version  |
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Marco Masseroli, Francisco O'Valle, Raimundo G. del Moral.
[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]
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Para cuantificar automáticamente la hipercelularidad glomerular realizamos una aplicación de análisis de imagen que permite el recuento automático de los núcleos de células glomerulares en secciones histológicas. Sus componentes principales se muestran en la Figura 1. Después de un paso preliminar en el que se inicializa el sistema, se carga la escala geométrica y se definen las condiciones de adquisición y medición, el programa se desarrolla en dos partes distintas: 1) adquisición y procesamiento de la imagen digital, 2) análisis de la imagen procesada y medición de parámetros.
Imágenes histológicas de secciones de especímenes renales teñidas con hematoxilina progresiva de Mayer se digitalizaron en blanco y negro con una resolución de intensidad luminosa de 8 bits (256 niveles de gris) y con un aumento global de 200X (Fig. 2 A). El tamaño de la imagen óptica fue de 44221.34 µm² para una imagen de 256x256 pixeles cuadrados, lo que resultó en una resolución óptica de 0.67 µm² / pixel. Las imágenes analógicas se adquirieron usando un filtro óptico azul y ajustando el enfoque para obtener una imagen lo más nítida posible. Un solo plano de enfoque por cada 4 µm de espesor de la sección histológica resultó adecuado para el análisis.
El procesamiento de la imagen digital permitió la segmentación e identificación de los elementos de interés en la imagen mediante una sucesión de algoritmos que incluyeron: doble umbralización de los niveles de gris de la imagen, filtraje automático de morfología matemática e identificación interactiva de la región glomerular.
La doble umbralización genera una imagen binaria en la cual se aíslan los núcleos celulares presentes en la imagen, seleccionando para cada núcleo al menos algunos pixeles (Fig. 2 B). De esta manera se reducen las conexiones entre núcleos adyacentes o parcialmente superpuestos y se identifican los núcleos de pequeño tamaño para diferenciarlo de las partículas de "ruido" (pocos pixeles de tamaño) que son sucesivamente eliminadas de forma automática.
El filtraje de morfología matemática implementado permite separar e identificar individualmente núcleos celulares conectados o parcialmente superpuestos 3, 4. Además elimina las pequeñas partículas de "ruido de umbralización" debidas a artefactos de tinción o a la propria imagen histológica que inducirían a error al ser contadas automáticamente como núcleos celulares.
La identificación de la región glomerular en la imagen se realiza de forma interactiva simplemente trazando una línea poligonal cerrada alrededor del flóculo de forma que incluya todos los núcleos que se quieren contar (Fig. 2 C). La extracción de esta permite aislar los núcleos de células glomerulares de los demás núcleos celulares presente en la imagen (Fig. 2 D).
Para mejorar la precisión del contaje nuclear, si después de los pasos de elaboración de imagen antes descritos permanecieran núcleos conectados, estos pueden ser separados continuando a través de su superficie el trazado de la línea poligonal utilizada para la identificación de la región glomerular.
En esta sección todos los núcleos de células glomerulares extraídos durante el procesamiento de la imagen son contados automáticamente y cada área nuclear aislada es mostrada superpuesta a la imagen inicial preelaborada para que se pueda evaluar inmediatamente la precisión del contaje (Fig. 2 E). Los resultados se archivan en ficheros ASCII de datos, donde cada línea se refiere a una imagen evaluada y contiene el nombre de la imagen y el número de núcleos de células glomerulares cuantificado. Esta organización facilita el manejo de los datos y su exportación a cualquier programa externo para ulteriores tratamientos con paquetes estadísticos.
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