III. BASES METODOLOGICAS E INSTRUMENTALES




Con el objeto de obtener unos resultados fiables y reproducibles consideramos fundamental una metodología rigurosa en consonancia con las recomendaciones de la Conferencia de Consenso en todos los aspectos que a continuación mencionaremos.

1. Toma y conservación de las muestras.
El material utilizado para Citometría de ADN debe reflejar la composición de la muestra de la que procede. Es conocido el hecho de que distintos tipos de tumores presentan heterogeneidad locorregional, por tanto la muestra deberá ser seleccionada por un patólogo, de tal forma que sea adecuada (componente tumoral neto, cantidad suficiente, ausencia de necrosis, sangre o grasa) y representativa (tomada de distintas regiones y a distinta profundidad).
El estado de conservación de la muestra es un factor importante a tener en consideración. Puede tratarse de material fresco o congelado, así como de células procedentes de material incluido en parafina las cuales ya han sido fijadas. En términos generales, para la cuantificación de ADN, la fijación previa del material es innecesaria.

2. Transporte y almacenaje
Este es otro aspecto determinante para garantizar unos resultados de calidad. El tipo de transporte depende de la proximidad así como de la disponibilidad del citómetro. Es crucial que el tiempo entre la extracción de la muestra y el procesamiento o la conservación del mismo sean mínimos. La muestra puede ser congelada directamente sin disgregar o en forma de suspensión celular en medio tamponado de citrato con un 0.1% de DMSO. El almacenamiento que mejor y durante más tiempo conserva las muestras es el nitrógeno líquido.

3. Obtención de suspensiones celulares
Disgregación
Un paso decisivo e imprescindible en la cuantificación de ADN por Citometría de Flujo es la obtención de suspensiones celulares. El tratamiento de la muestra depende fundamentalmente de dos factores: por un lado la naturaleza de la muestra, y por otro su estado de conservación.
La disociación celular continúa siendo el mayor obstáculo en la preparación de las muestras para citometría de flujo en el caso de tejidos sólidos.
Para disgregar un tejido sólido hemos de tener en cuenta que la mayoría de las células de los organismos pluricelulares están en relación con una intrincada trama de macromoléculas extracelulares que constituyen la llamada matriz extracelular. En el caso concreto de los tejidos epiteliales, las células se encuentran frecuentemente unidas por desmosomas y con muy poco material intercelular adyacente. Los enlaces extremadamente rígidos existentes hacen que la disociación del epitelio sea un proceso difícil.
Existen numerosas técnicas descritas para la separación celular: enzimática (tripsina, pepsina, pronasa, etc), mecánica (bisturí, tijeras, aguja), mediante reactivos químicos como EDTA o EGTA, o detergentes (Nonidet P-40, Triton X-100, etc). Para la preparación de una suspensión de células singulares dichas técnicas pueden ser utilizadas, aunque no existe una técnica adecuada para todas las circunstancias. A pesar de ser un paso crucial en el estudio citométrico la literatura rara vez especifica la técnica de disgregación utilizada en detalle, siendo este un tema a discutir y consensuar. Nosotros utilizamos una disgregación combinada mecánica (cortando el tejido con bisturí en pedacitos de 1mm) y enzimática (tripsina).
Tras una disgregación habrán de tenerse en cuenta las siguientes consideraciones:
1. Heterogeneidad y representatividad de la muestra
2. Rendimiento de la disgregación (pérdida selectiva de células)
3. Estado de células o núcleos. (Revisar mediante examen citológico)
4. Proporción detectable de eventos anómalos (por ej. aneuploides).
5. Tipo o tipos celulares presentes (inflamación?)

Control citológico

Con el fin de garantizar una buena muestra de partida para el análisis citométrico, es fundamental realizar un control del estado de las células tras la disgregación. Para ello procedemos a teñir mediante un Giemsa rápido y archivamos las laminillas con el mismo número de registro que el estudio citométrico.(Fig 9).


Tinción con Giemsa rápido     Fig 9.

4. Tinción del ADN

El procedimiento más utilizado para la tinción del ADN, descrito por Vindelöv et col., comprende tres fases:
1. En primer lugar, se incuba la suspensión con una disolución de tripsina para facilitar la digestión de membranas y otros restos celulares en medio de reguladora citrato.
2. Un segundo paso comprende la inhibición de esta digestión y adición de ARNasa para eliminar el ARN presente.
3. En un tercer paso se procede a la tinción con Ioduro de propidio (concentración final de 50 mg/ml). Es un colorante de intercalación del ADN y ARN, considerándose su unión estequiométrica, siempre que se encuentre a una concentración saturante. Tras la incubación de la suspensión en estas tres disoluciones durante diez minutos en cada una de ellas, la muestra está preparada para ser adquirida en el Citómetro de Flujo. En la fig 10 se muestra el aspecto de la suspensión celular preparada mediante esta técnica, imagen obtenida por Microscopía Láser-Confocal.


suspensión celular     Fig 10.

5. Estándares y controles.

Aunque algunos autores proponen el uso de linfocitos o células rojas nucleadas de otras especies como estándar, se ha comprobado que la desviación de la fluorescencia del estándar respecto a la esperada del pico diploide puede ser consecuencia de variaciones en el enlace con el fluorocromo o porque las células estén muertas o en proceso de muerte celular, en apoptosis o con su DNA dañado. Por todo ello el mejor estándar es el componente sano del mismo tejido. En nuestra experiencia utilizamos siempre que es posible tejido sano del mismo órgano y del mismo individuo que procesamos en paralelo a la muestra tumoral.Para comprobar la linealidad del instrumento utilizamos una suspensión de eritrocitos de pollo.

6. Análisis citométrico de ADN

Ajuste instrumental y adquisición.
Una vez que la suspensión de núcleos está preparada para ser introducida en el Citómetro de Flujo, se adquieren los datos que posteriormente nos darán información a cerca de esa muestra. En la adquisición es necesario tener en cuenta una serie de consideraciones de carácter instrumental así como de manejo, estas son las siguientes: selección de los parámetros de interés, comprobación de la linealidad del citómetro (calibración), y establecimiento del número de células a analizar (10-20.000).
Análisis de datos e interpretación del histograma de ADN.
Los histogramas de ADN requieren un análisis matemático para extraer información a cerca de las fases del ciclo celular y de la ploidía.
El contenido real de ADN exhibe siempre distribuciones con cierta varianza en torno al valor 2C debido al proceso de tinción, errores instrumentales y/o diferencias de célula a célula en el contenido en DNA. La colección de datos en un histograma se encuentra distribuida en canales o intervalos de resolución donde pueden recogerse uno o más picos modales. Por tanto, en un histograma diploide veremos un primer pico correspondiente a las células G0/G1, un segundo pico de menor número de células correspondiente a G2/M y una banda entre ambos picos correspondiente a la fase S. En un histograma aneuploide se observará además la presencia de otra u otras poblaciones además de la diploide en las cuales puede también distinguirse las fases G0/G1, S y G2/M de las poblaciones aneuploides.

Histograma aneuploide

Existen distintos métodos desarrollados en las últimas dos décadas de mayor o menor complejidad para evaluar las fases de proliferación en el Ciclo Celular. Se pueden encontrar en el mercado varios programas informáticos específicos para el análisis de ciclo celular.

Calidad de los resultados
En el informe del contenido de ADN por CF de una muestra tumoral deberán estar reflejada al menos la siguiente información:

El grupo de Oviedo hemos realizado un estudio de control de calidad poniendo a disposición de las personas interesadas los histogramas analizados de 10 casos de colon de difícil interpretación junto con los ficheros que generaron dichos histogramas para su discusión por red. La dirección de INTERNET es la siguiente:
http://www10.uniovi.es/sic/casos.htm


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