La investigación del pronóstico y de la patogenia de las neoplasias de la mama puede hacerse estudiando la ploidia o cantidad de DNA, la fracción de células en proliferacion o fase S y la mofometría de estructuras tisulares como el área núclear, nucleolar y de los vasos sanguineos.
|
|
Auer, Caspersson y Gustafsson en 1980 (1), demostraron en un trabajo retrospectivo con citometría estática que la cantidad de DNA o PLOIDIA de los tumores de mama se relaciona con la superviviencia de los pacientes. Clasificaron los tumores en cuatro grupos. El I se asociaba a una buena supervivencia de las enfermas a los diez años y en la citometria los tumores eran diploides, los del grupo IV sobrevivían menos de dos años y los tumores eran muy aneuploides. Los incluidos en los grupos II y III presentaban histogramas tetraploides o una combinacion de tetraploide y diploide, (Fig 11). Muchos trabajos posteriores de citometría estática y de flujo han corroborado el valor de la ploidía para la predicción del pronóstico sobre la supervivencia de los pacientes al cáncer de mama, demostrando que es un marcador pronóstico independiente. La mayoría de los trabajos se han hecho con citometría de flujo y en ellos las lesiones mamarias benignas son todas diploides (2). Las lesiones malignas, sin diferenciar tipos tumorales ni estadios de enfermedad, son aneuploides entre el 35 al 70% de los casos.(3, 4, 5, 6). (Figs 12 y 13). Los tumores con poblacion aneuploide multiploide son los de peor pronóstico. Uno de nuestro grupo encontró que los tetraploides son los peor pronostico (Fig 13). En un estudio de carcinomas de diversos origenes (177 de mama, 81 de laringe y 62 de colon) se observo que la aneuploidia más desfavorable, con recaidas antes y menor supervivencia, ocurria en los aneuploides hiperploides (7). Además la aneuploidia es un valor bastante constante pues se encuentra ya presente en los carcinomas in situ de alto grado de malignidad (8), lo que esta en consonancia con la hipótesis de que la agresividad del cáncer de mama permanece constante mientras el tumor progresa (9). Los tumores diploides y sus metastasis tienden a mantener la ploidia durante decadas.(Fig 14). |
Sin embargo hay que tener en cuenta que algunos tipos de carcinoma pueden presentar valores engañosos de ploidia. Ello ocurre en el carcinoma coloide, de conocida baja malignidad, en el que aparecen casos muy aneuploides debido a las celulas degeneradas (10), en los carcinomas medulares, una ploidia elevada se asocia con mejor pronostico que los ductales (11) quiza por la menor tendencia a las metástasis. Se acepta que la ploidia se correlaciona con el pronóstico de los carcinomas ductales pero no con el de los lobulillares o medulares(12). Los tumores neuroendocrinos de la mama pueden presentar un pico próximo a tetraploide(13) ó aneuploidia (14).
Por todo lo anterior es conveniente que los estudios reúnan tumores de tipos histológicos determinados y con homogeneidad morfológica(15). Así hicimos un estudio de citometría estática en 97 carcinomas ductales clásicos invasores, M0 y de tamaño pequeño en la mama. 60 seguimos al menos durante 5 años y encontramos correlación estadísticamente significativa entre ploidia, ID, y pronostico. Los tumores diploides eran los de mejor pronostico, seguidos de los aneuploides, tetraploides e hipertetraploides. El 49% eran aneuploides y si incluíamos los tetraploides e hipertetraploides el 79%. El estudio de la fracción de la fase S también era un factor pronostico significativo observándose un peor pronóstico cuando era mayor del 20% (González ML, Furió V, Pelayo A, Aguilar AL, Roman JM, Escudero M y Fariña J).
La ploidía se obtiene por citometria estatica o de flujo con la única advertencia de que algunos picos aneuploides cercanos al diploide pueden no ser observados en la citometria de flujo, y esto ocurre hasta en un 10% de los casos clasificados como diploides por la citometria de flujo. Los estudios de citometria desde material citológico como la PAAF ayudan a decidir la terapéutica.(14, 16, 17 ).
La ploidía encontrada en piezas fijadas en formol e incluidas en parafina coincide en el 89% de los casos con la obtenida en tejido fresco (18). Muy probablemente los detritus celulares generados al destruir el bloque y la mayor fragilidad de las células malignas al procesamiento de disociación ayudan a explicar estos resultados. Los trabajos que utilizan material fresco consiguen una relación mayor entre pronostico y ploidia que los realizados con material fijado. En general para diagnóstico se debe usar material fresco o congelado, aunque para estudios retrospectivos, en los que se puede hacer seguimiento más fácilmente, el material en parafina es válido pues hay abundante bibliografía sobre la correspondencia entre ambos tipos de muestra.
Sin embargo hay que buscar la concordancia en la valoración de los resultados de los diferentes observadores. Un grupo sueco, Baldetorp y cols., en 1995 encontraban discrepancias en la definición de casos tetraploides y de la estimación de la fase S de proliferacion celular en un estudio de 67 muestras investigadas en 12 laboratorios (19). En 1996, seis grupos analizaron 1295 histogramas de citometria de flujo coincidiendo en los casos diploides, hiperdiploides y multiploides pero había un 6% de discordancias por las distintas interpretaciones de los histogramas tetraploides (20).
En nuestro laboratorio en citometria estatica desde bloques de parafina seguimos las pautas indicadas por Kallionemi que establece el histograma segun el índice de DNA: Los tumores diploides en mama tienen un ID de 0,75 a 1,25, los aneuploides de 1,25 a 1,8, los tetraploides de 1,8 a 2,2 e hipertetraploides por encima de 2,2 (21). (Fig 15).
En cuanto a los estudios de PROLIFERACION CELULAR, hay controversia sobre cual es el parámetro que circunscribe mejor las células tumorales que están sintetizando DNA. La mayoría de los trabajos lo hacen estudiando la fracción de fase S que se correlaciona con los resultados obtenidos con bromodeoxiuridina y Ki-67, pero otros buscan el porcentaje de células que están en fase S y G2-M. Sin embargo Sharma y González y cols (22, 23), entre otros demostraron que si se quita el efecto de la fracción de la fase S sobre el pronóstico, la fracción de la fase G2-M pierde el valor pronostico por lo que podemos prescindir de ella para calcular la actividad proliferativa tumoral. La fracción de la fase S es el mejor parámetro relacionado con el tiempo libre de enfermedad (24, 25).
En 881 pacientes de carcinoma de mama
estudiados con citometria de flujo Camplejohn y cols., ven que el
valor de la fase S de proliferacion celular es un marcador de la
supervivencia a la enfermedad, del período libre de recaída y
de la supervivencia despues de esta. La fiabilidad para la
supervivencia y el período libre de recurrencia sólo es
superada por el status ganglionar, pero para pronosticar la
supervivencia tras la recaída es el marcador mas fuerte.(Fig 16). Comparada con otros parámetros, la
fracción de celulas en proliferacion medida por el pico S es un
factor pronostico independiente del grado de tumor y estadio,
tamaño tumoral, edad del paciente, status ganglionar, menstrual
y de algunos tratamientos. Es pues un predictor muy importante de
la evolución clínica que va a tener un tumor de mama(26).
Como ocurria en la ploidía también es preciso tener en cuenta que los valores de la fase S varían segun la fijación y la preparación del material. En la citometría de flujo los tumores diploides tienen valores mas bajos de fracción de fase S porque también miden células normales. Esto puede obviarse haciendo marcaje selectivo de las células tumorales con anticuerpos específicos. Por otra parte en los estudios desde parafina los restos tisulares tras la digestión enzimática se superponen al histograma en citometría de flujo dando valores de fase S más elevados. Este problema no ocurre en la citometría estática al elegir de forma interactiva las células tumorales. Pero en este caso tenemos la limitación de que el número de células investigados es pequeño. Además está el problema general de que no existe un acuerdo sobre el nivel de corte. La mayoría de los autores consideran en la citometria de flujo que los tumores con valor medio de la fracción de fase S hasta el 11% tiene un buen pronóstico y malo cuando superan este porcentaje. Sigurdson (27), propone tres grupos, de mejor a peor pronóstico, situados en menos del 7%, entre el 7 y 11,9% y por encima del 12%. En la citometría estática los porcentajes varían algo, siendo más elevados en los aneuploides, y más bajos en los diploides, porque solo contabiliza células tumorales. La Dra. ML González obtuvo en el trabajo precitado valores de 9,5 en los carcinomas diploides, 14,2% entre todos los aneuploides, 19.4% en los tetraploides y 22% en los hipertetraploides. Al establecer el nivel de corte en el 20% se obtenía un factor pronóstico independiente que separaba a las enfermas de bajo y alto grado de malignidad. En los histogramas tipo mosaico no es posible obtener este dato.
Otros valores cuantimétricos de importancia en la glándula mamaria son el índice de actividad mitótica (MAI), el índice pronóstico morfométrico paramétrico (IPMM) , algunos estudios morfométricos nucleares y la medida de la angiogénesis.
El INDICE DE ACTIVIDAD MITOTICA se obtiene contando las mitósis en 10 campos consecutivos de gran aumento. Realizado de forma manual es muy subjetivo y no puede ser reproducido por distintos observadores. Sin embargo efectuado con análisis de imagen es un factor pronóstico individual potente. A mayor valor hay peor pronóstico para la paciente (28). El índice de mitosis se correlaciona con los resultados del Ki-67, el MIB-1 y la fracción de fase S de proliferación celular (29).
El índice pronóstico morfométrico multiparamétrico o multivariante se calcula segun la formula descrita por BAAK y cols en 1985 (28):(Fig 17 y 18).
IPMM= 0,3341(Raíz cuadrada de MAI)+ 0,2342 X Tamaño del diámetro tumoral mayor en centímetros- 0,7654 X Status ganglionar(afectado=1, negativo=2)
Si es inferior a 0,60 el pronóstico es bueno y por encima de este valor el pronóstico en cuanto a recurrencia y supervivencia es malo. Es un método fácil, barato pues se hace con hematoxilina eosina, aunque como todos los de análisis de imagen relativamente lento. Nuestro grupo, MJ Fernández-Aceñero, P Aragoncillo, J Fariña, A Pelayo y V Furió hemos encontrado resultados concordantes en 112 tumores de mama seguidos hasta 5 y 10 años.
En general la medida de diversos anticuerpos con la citometría permite la cuantificación de la inmunohistoquímica. La valoración más adecuada de los receptores hormonales implica entre otros requisitos la utilización de la citometría estática. Aunque el valor de los receptores hormonales está en discusión (30, 31), se sabe que responderán al tratamiento el 60% de los casos positivos a receptores de estrogenos, y hasta el 10% de los negativos (32, 33). En la Figura 19 se observa la positividad a receptores de progesterona.
Fig. 19. Receptores de progresterona en
carcinoma de mama
|
En 1991 Weidner y cols. (34), hicieron un trabajo fundamental con tan sólo el estudio de 49 casos de cáncer de mama. Demostraron que los tumores con muchos capilares y venulas tenían peor pronóstico y se correlacionaban con presencia de metástasis en los gánglios linfáticos,(Fig 20). Se atisbaba que el gran problema de adivinar la extension extramamaría de la enfermedad quizá estaba cerca de resolverse. Se sucedieron posteriormente otros trabajos en mama y otras localizaciones comprobándose que la angiogénesis es un parámetro predictor del crecimiento, la progresion y la capacidad metastásica de los tumores. Gasparini y Harris en 1995 (35), (Fig 21), sistematizan bastante la metodología: Se deben de utilizar marcadores endoteliales como el factor VIII endotelial, CD-31 ó CD-34. La medición se refiere a vénulas y capilares, midiendose tanto los vasos con luz como las yemas vasculares sólidas. El campo a medir es al menos de 0,74 a 1,00 milímetro cuadrado y se observa a 200 aumentos. La zona elegida es muy importante. Se busca a bajo a umento, 40X ó 100X, es la llamada "HOT SPOT" y suele estar en los márgenes del carcinoma, en el estroma próximo a las células tumorales. (Fig 22). Los vasos incluidos en zonas escleroticas no se contabilizan. El estudio se hace simultánemente por dos observadores. En 1996, J. Fernández-Aceñero, J. Fariña y P. Aragoncillo en 112 casos de carcinoma ductal invasor, de tamaño pequeño en la mama y sin metástasis a distancia (M0) encontramos que la medida de la angiogénesis marcada con factor VIII era un factor pronóstico independiente en el análisis univariante y multivariante entre 21 factores (36 y 44). |
 Fig. 22. Adenocarcinoma de mama. Hot Spot. |
|
Otras medidas relacionadas con el pronóstico son la textura de la cromatina y el área nuclear, (37, 38), el área nucleolar teñida con técnicas de plata (AgNOR) (39, 40), el área glándular del tumor y la distribución en el espacio de los ejes mayores de los núcleos de las células tumorales (41) y el número de células en apoptosis (42).
Gilles y cols. en 1994 estudiaron con análisis textural 40 cistosarcomas fillodes apuntando que podia ayudar a discriminar entre casos benignos, borderline y malignos. Así mismo, en este estudio 20 sarcomas extramamrios eran diferneciados en la mayoría de los casos de los cistosarcomas malignos (43).
