Ramon Bosch Príncep, Tomás Álvaro Naranjo, Salomé Martínez González, Bárbara Tomás Arasa, María del Mar Barberá Marro, Rosa Risa Royo, Ana Suñé Martín y Mª Teresa Salvadó Usach.
Hospital de Tortosa Verge de la Cinta
[Resumen][Introducción][Material y Métodos][Discusión][Bibliografía][Iconografía]
Introducción: Los bloques multimuestra (BMM) son bloques de parafina que contienen múltiples muestras pertenecientes a casos diferentes permitiendo la evaluación simultánea de múltiples casos sobre un mismo portaobjetos y la realización de técnicas inmunohistoquímicas sobre ellos con un ahorro importante de tiempo y anticuerpos. También han sido denominados salchichas multitumor, bloques tisulares multitumor, bloques tisulares multitejidos, bloques de tejido en tablero de damas y rollos suizos. El objetivo del presente trabajo es la descripción del método usado en nuestro departamento para la obtención de BMM, la valoración de su uso y la comparación con otros métodos publicados previamente.
Material y método: Las muestras incluidas en el bloque se obtienen mediante un
punch cutáneo de 4 mm de diámetro adaptado para la extracción de muestras. La
muestra se obtiene a partir de los bloques previamente estudiados con HE y de
los que se ha seleccionado la zona representativa del tumor o de la lesión a
estudiar.
Resultados y conclusiones:
El uso de BMM permite un ahorro importante de tiempo y recursos económicos y su
realización es un procedimiento sencillo y económico. El uso rutinario de los
BMM es el de servir como controles de inmunohistoquímica y su uso en
investigación permite realizar estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in
situ con un volumen importante de casos. Con este método pueden hacerse
estudios retrospectivos, garantizando la especificidad de la muestra estudiada
y permitiendo estudiar fenómenos y áreas concretas de tejido.
Los bloques multimuestra1 (BMM) son bloques de parafina que contienen múltiples muestras que pueden pertenecer a casos y/o individuos diferentes. Los BMM comprende las denominadas las salchichas multitumor,2 los bloques tisulares multitumor, bloques tisulares multitejidos3, bloques de tejido en tablero de ajedrez4 y rollos suizos.5 Estos bloques permiten la evaluación simultánea de diferentes muestras sobre un mismo portaobjetos y son utilizados en estudios inmunohistoquímicos en los que una única gota de anticuerpo permite testar incluso más de 100 muestras. En nuestro servicio los BMM son usados como controles rutinarios de las técnicas inmunohistoquímicas así como en estudios de investigación inmunohistoquímicos y de hibridación in situ.
El objetivo del presente trabajo es describir el
procedimiento técnico usado en realización de los BMM en nuestro servicio así
como comentar sus usos y sus ventajas e inconvenientes.
Elaboración de BMM:
Los BMM realizados en nuestro servicio contienen un número variable de muestras
dependiendo fundamentalmente de la finalidad del bloque (investigación o
control de inmunohistoquímica) y de los diferentes tejidos que contenga.
Las muestras incluidas en el bloque se obtienen mediante un punch cutáneo de 4
mm de diámetro adaptado para la extracción de muestras. La muestra se obtiene a
partir de los bloques previamente estudiados con HE y de los que se ha
seleccionado la zona representativa del tumor o de la lesión a estudiar. Se
seleccionan así mismo áreas con grosores de tejido adecuados y bloques poco
rebajados para evitar cilindros de tejido de poco grosor. Una vez obtenidas las
muestras con el punch, se emplazan temporalmente los cilindros obtenidos en un
cassette correctamente identificado y después son sumergidos los cassettes en
el baño de parafina líquida para posteriormente elaborar un BMM en el que se
identifica la primera de las muestras dándole una forma triangular y el resto
siguiendo una sistemática constante (ver figura 1).
Las secciones obtenidas a 2 micras son teñidas con Hematoxilina-Eosina
siguiendo el procedimiento rutinario. Se realizan las técnicas de
inmunohistoquímica siguiendo los procedimientos habituales de nuestro
laboratorio. El sistema de amplificación y visualización que estamos usando es
EnVisionTM (Dakopatts, Copenhagen, Dinamarca). En Hibridación in situ para
detección de VEB (EBER-1) seguimos el siguiente procedimiento: Secciones de 2
micras del BMM son montadas sobre portaobjetos gelatinados. Los EBER-1 son
detectados usando sondas de oligonucleótidos marcados con isotiocianato de
fluoresceína (Y017, Dakopatts, Copenhagen, Dinamarca) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Usos habituales de BMM en nuestro servicio:
1- Como controles inmunohistoquímicos usamos:
a. Un control linfoide.
b. Un control mesenquimal.
c. Un control epitelial
d. Un control de receptores hormonales.
2- Como Bloques multimuestra para estudios retrospectivos inmunohistoquímicos estamos usándolos para la revisión de todos los procesos linfoproliferativos (PLP) diagnosticados en nuestro servicio hasta finales de 1999. Para ello se han dividido los PLP en Linfomas no Hodgkin y EH basándonos en la revisión histológica de los portaobjetos procedentes de nuestro archivo. Se han seleccionado áreas de bloques con representación tumoral y grosores lo más amplios posibles.
3- Bloques multimuestra para estudios retrospectivos de Hibridación in situ: hasta el momento actual únicamente hemos usado los BMM para el estudio de la presencia de Virus de Epstein-Barr en el tejido de PLP. Tras el estudio paralelo de 50 casos de linfomas (40LNH y 10EH) con EBERs sobre secciones de todo el material del bloque y compararlo con el resultado del EBERS practicado sobre sección de los BMM elaborados y siendo los resultados paralelos, llegamos a la conclusión que el uso de BMM puede ser muy útil para el ahorro de tiempo y recursos económicos en la hibridación para EBERS.
Desde que en 1986 Battifora describió un método de elaboración de BMM que denominó Bloques Salchicha Multitumor6 varios han sido los artículos publicados sobre el tema. Estos artículos describen básicamente procedimientos y estudios inmunohistoquímicos que sirven para probar anticuerpos monoclonales y monitorizar su sensibilidad inmunohistoquímica; alguno de estos artículos describe también el uso de los BMM como controles de calidad inmunohistoquímica. En el presente trabajo nosotros hemos comentado nuestra experiencia en el uso de los BMM como controles inmunohistoquímicos así como el uso de éstos en la realización de trabajos retrospectivos inmunohistoquímicos al igual que su utilidad en hibridación in situ para EBERS.
Existen dos grandes grupos de BMM: Las salchichas multitejidos y los BMM con identificación precisa de las muestras. Las “salchichas” son BMM que contienen múltiples muestras pero que no permiten una localización e identificación exacta de las muestras pero que siguen siendo útiles para testar anticuerpos y para controles rutinarios en los laboratorios de inmunohistoquímica. En las salchichas, las muestras tisulares son envueltas con el material usado para la elaboración de salchichas comestibles4,6 o son envueltas con una membrana elaborada a partir de membrana alantoidea.2
El segundo grupo de BMM son los que permiten una identificación precisa de cada una de las muestras incluidas en el bloque y permiten por ello estudio de casos problema histológicamente similares. La elaboración de los BMM con identificación exacta de las muestras puede realizarse a partir de muestras parafinadas, a partir de tejido fresco y incluso pueden ser obtenidos de material que haya sido fijado con diferentes fijadores.4 Los BMM en tablero de damas descrito por Battifora en 19904 permiten el estudio de un gran número de muestras aunque se requiere de una metodología en la recogida de muestras más compleja y costosa que requiere una inclusión en agar y un aparataje especialmente desarrollado que no se encuentra al abasto de los servicios de patología corrientes. Únicamente en una publicación previa se describe un método similar al que estamos utilizando nosotros y que usa punch cutáneos para la extracción de muestras.7
La sistemática que se ha descrito en el presente trabajo es un método rápido de elaboración de BMM especialmente útil en estudios retrospectivos con muestra escasa (permitiendo usar una porción pequeña de la muestra en la elaboración de los BMM). Otra ventaja de este sistema es que permite la selección de áreas previamente estudiadas con HE asegurando la representatividad de la lesión problema y garantizando la especificidad de la muestra estudiada y así como permitiendo estudiar fenómenos y áreas concretas de tejido. Los inconvenientes de este método es que se requiere de bloques poco agotados ya que de lo contrario se producirá un agotamiento prematuro de la muestra en el BMM. A pesar de ello este es un problema que se producirá en todos aquellos estudios retrospectivos en los que se disponga de poco material siendo más rápido el agotamiento sin el uso de BMM o sin la fragmentación del bloque.
El número máximo de muestras que hemos incluido en los BMM es de 25 ya que
hemos buscado una superficie de tejido grande en los estudios de investigación
(un punch de 4 mm de diámetro presenta una superficie de 12,6 mm2).
En algunos controles inmunohistoquímicos hemos usado mitades o cuartos del
cilindro de 4 mm para reducir el consumo de los controles; pueden ser usados
punch de 3 mm de diámetro con idéntica finalidad (la superficie que se estudia
con este punch es de 7,1 mm2).
La realización de BMM es un procedimiento relativamente sencillo y económico
que permite un ahorro importante de tiempo y recursos económicos tanto para
tareas rutinarias (controles de inmunohistoquímica) como de investigación
mediante inmunohistoquímica al igual que para estudios con hibridación in situ.
Otros sistemas de elaboración de BMM requieren de una infraestructura com y el
método de elaboración más complejos4
