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Página Principal Comunicaciones	EL GEN DE LA BETA-TUBULINA NO ESTÁ MUTADO EN LOS ESTADIOS TEMPRANOS DEL CARCINOMA PULMONAR NO MICROCÍTICO Dr José Javier Gómez Román , Dra Ana Fontalba Romero* , Dra Marta López-Brea Piqueras** , Dr José Luis Fernández Luna* y Dr José Fernando Val Bernal Dpto Anatomía Patológica, *Servicio de Inmunología Clínica y **Oncología Médica. Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Servicio Cántabro de Salud. Facultad de Medicina. Universidad de Cantabria Santander España
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen OBJETIVOS. Estudiar la presencia de mutaciones en el exón 4 de la beta-tubulina en carcinomas no microcíticos pulmonares en estadios I, II and III MATERIAL Y METODOS. Se estudiaron 83 carcinomas pulmonares no microcíticos recibidos en el Dpto de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla entre 1998 y 1999. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento quimioterápico previo a la cirugía.. Las muestras tisulares se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Para la extracción de AND se practicaron varios cortes de15µm de espesor en criostato y se colocaron en un tubo Ependorff estéril de 1,5 ml. Se realizó una sección de 5 µm de control que fue teñida con Hematoxilina y Eosina para verificar la naturaleza neoplásica de la muestra. Todas las muestras fueron analizadas mediante secuenciación automática de ADN para el exón 4 de beta-tubulina. RESULTADOS. Se evaluaron 45 carcinomas epidermoides, 25 adenocarcinomas, 10 carcinomas de células grandes y 3 carcinomas adenoescamosos. 30 casos correspondieron al estadio IA y IB (36,1%), 22 casos fueron estadios IIA y IIB (26,5%), y 31 casos fueron estadios IIIA y IIIB (37,4%). La secuenciación de AND no mostró ningún caso de mutaciones en el exón 4 de la beta-tubulina. CONCLUSIONES. Nuestro estudio muestra la ausencia de mutaciones en el exón 4 de la beta-tubulina en 83 casos de carcinomas pulmonares no microcíticos en estadio I, II y III. La terapeútica basada en taxanos en estadios tempranos podría ser de utilidad en ensayos clínicos debido a la ausencia de factores de resistencia relacionados con la beta-tubulina. Los estadios tempranos de carcinomas pulmonares no microcíticos deben ser evaluados buscando otros mecanismos de resistencia a drogas.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción Los microtúbulos son estructuras esenciales para la vida celular. Están formados por heterodímeros de una proteína llamada tubulina polimerizada y participan de diferentes funciones celulares como son la del mantenimiento del contorno celular, la formación de los husos mitóticos en la fase M del ciclo celular y el transporte axonal entre otras. La proteína tubulina está formada por dos subunidades, alfa y beta que forman estructuras heterodiméricas. La proteína beta tiene 445 aminoácidos y está codificada por cuatro exones localizados en el brazo corto del cromosoma 6, en concreto en la región 6p21.3. Las dos subunidades son capaces de unirse a GTP, pero la subunidad alfa se ha comprobado que tiene un papel predominantemente estructural, mientras que la beta está implicada directamente en el proceso de polimerización, depolimerización y mitosis. Este proceso es fundamental para la célula, ya que para que se complete el ciclo celular y ésta entre en mitosis, es preciso que la tubulina se depolimerice y se puedan separar las dos células resultantes del proceso. El paclitaxel, una droga utilizada para el tratamiento de pacientes oncológicos, se une fundamentalmente a la beta tubulina e impide que ésta se depolimerice con lo que en definitiva actúa impidiendo la replicación celular. Éste es el mecanismo fundamental de acción anticancerígeno. Por otro lado, existen múltiples isotipos de la proteína tubulina que forman parte de una familia compleja Fig_1, con seis miembros principales con un patrón diferencial de expresión génica dependiendo del tejido de origen. El papel que se cree desempeñan los diferentes isotipos de la tubulina puede ser el unirse a diferentes proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) y contribuir a la variabilidad funcional de los microtúbulos. Se han observado incrementos en la expresión génica de beta tubulina en tumores resistentes a taxanos, con lo que parece que podría existir una relación entre la función de la tubulina y el mecanismo de acción de la droga En carcinomas de pulmón, se ha descrito que hasta un 33% de los carcinomas no microcíticos presentaban mutaciones en el exón 4 de la beta tubulina Fig_2. Por tanto, la proteína tubulina es esencial para la estabilidad de los microtúbulos, y éstos a su vez son esenciales para la división celular. El paclitaxel se une principalmente a la beta tubulina. Es decir, si la tubulina se encuentra mutada en los sitios de reconocimiento por parte de los taxanos, éstos no podrán desarrollar su función impidiendo la replicación celular. Es decir, estaríamos hablando de un mecanismo de resistencia a drogas. Sin embargo, es preciso recalcar que existen otros mecanismos de resistencia como la inducción de la glicoproteina P, la propia sobreexpresión de beta tubulina o la pérdida de p53 Nuestro objetivo es estudiar la presencia de mutaciones en los estadios quirúrgicos del carcinoma pulmonar no microcítico. Zoom Fig 1 Isotipos de la proteína tubulina con su expresión en tejidos humanos Zoom Fig 2 Regiones codificantes de la beta tubulina con los hot spots (lugares más frecuentes de mutación) descritos
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Seleccionamos 83 carcinomas pulmonares no microcíticos diagnosticados durante los años 1998 y 1999 en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla en Santander (España). Todos ellos procedían de lobectomías y neumonectomías de tumores en estadios I, II y IIIA. En todos ellos se seleccionó tejido neoplásico y no neoplásico y se congeló en nitrógeno líquido procediendo a su almacenamiento a -80ºC. Se practicaron secciones en criostato y se tiñeron con HE para control histológico y el resto del material se utilizó para obtención de DNA. Se procedió posteriormente a una reacción de PCR-secuenciación del exón 4 (lugar de unión a GTP) del isotipo HM40 de la proteína beta tubulina. Para ello se utilizó un secuenciador automático de DNA ABIPrism (Applied-Biosystems) con dideoxinucleótidos marcados y supervisión de los electroferogramas. En todos los casos disponíamos de los datos de supervivencia Las condiciones de la PCR fueron las siguientes Fig_3: 200 ng DNA de partida (DNAzol Reagent. Life Technologies) 5 microl. 10x PCR buffer 1,5 microl. 50mM MgCl2 0,5 microl. 20mM dNTP 2 microl. (20pmol) oligonucleotide forward 2 microl. (20pmol) oligonucleotide reverse 0,25 microl. Taq (1,25 U) H2O. 50 microl. Thermal cycler (2400 Perkin Elmer) 95ºC - 5 minutes 30 cycles: 95ºC - 60 seconds 58ºC - 30 seconds 72ºC - 60 seconds Final extension: 72ºC - 3 minutes Secuenciación automática Purificación de la muestra:Concert PCR purification system, Life technologies Electroforesis 2% agarose gel with DNA mass ladder Automatic DNA cycle sequencing 50 ng purified PCR products 5 pmol each oligonucleotide forward/reverse 4 microl. Terminator Ready Reaction Mix (dRhod) H2O. 20 microl. Thermal cycler 95ºC - 60 seconds 25 cycles: 96ºC - 10 seconds 50ºC - 5 seconds 60ºC - 4 minutes Zoom Fig 3 Set de primers utilizados
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados Los diagnósticos histológicos y los estadios clínico-patológicos están recogidos en las Figuras 4 y 5 (Fig_4, Fig_5). La supervivencia general de los 83 tumores que formaban parte de la serie se presenta en la Fig_6. No hallamos ningún caso con mutaciones en el exón 4 de la beta tubulina. Mostramos varios electroferogramas para comprobar la calidad de los mismos Fig_7 Fig_8. Se revisaron de forma manual las secuencias tanto en dirección sentido como antisentido. Zoom Fig 4 Diagnósticos histológicos de la serie Zoom Fig 5 Distribución por estadios Zoom Fig 6 Supervivencia general de la serie Zoom Fig 7 Electroferograma Zoom Fig 8 Electroferograma 2
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión CONCLUSIONES No hemos hallado mutaciones en el exón de union a GTP de la beta tubulina en 83 casos de carcinoma pulmonar no microcítico Ninguno de los casos había sido tratado con protocolos de quimioterapia previos a la cirugía Las mutaciones en la Beta tubulina no explican todos los mecanismos de resistencia a los agentes anti-microtúbulos, por lo que deben existir rutas moleculares alternativas de resistencia Quizá un posible papel de la alpha-tubulina O la expresión diferencial de isotipos de tubulina, ya que las células normales son dependientes de muchas rutas celulares, pero las células neoplásicas son redundantes en las rutas que utilizan
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Bibliografia 1: Sarries C, Haura EB, Roig B, Taron M, Abad A, Scagliotti G, Rosell R. Pharmacogenomic strategies for developing customized chemotherapy in non-small cell lung cancer. Pharmacogenomics 2002;3:763-80. 2: Kohonen-Corish MR, Qin H, Daniel JJ, Cooper WA, Rivory L, McCaughan B, Millward MJ, Trent RJ. Lack of beta-tubulin gene mutations in early stage lung cancer. Int J Cancer 2002;101:398-9. 3: Tsurutani J, Komiya T, Uejima H, Tada H, Syunichi N, Oka M, Kohno S, Fukuoka M, Nakagawa K. Mutational analysis of the beta-tubulin gene in lung cancer. Lung Cancer 2002;35:11-6. 4: Rosell R, Felip E. Predicting response to paclitaxel/carboplatin-based therapy in non-small cell lung cancer. Semin Oncol 2001;28:37-44. 5: Monzo M, Rosell R, Sanchez JJ, Lee JS, O'Brate A, Gonzalez-Larriba JL, Alberola V, Lorenzo JC, Nunez L, Ro JY, Martin C. Paclitaxel resistance in non-small-cell lung cancer associated with beta-tubulin gene mutations. J Clin Oncol 1999;17:1786-93. 6: Chan MW, Chiang CD, Song EJ, Yang VC. Effects of cytoskeletal inhibitors on the accumulation of vincristine in a resistant human lung cancer cell line with high level of polymerized tubulin. Cancer Biochem Biophys 1998;16:347-63. 7: Kavallaris M, Kuo DY, Burkhart CA, Regl DL, Norris MD, Haber M, Horwitz SB. Taxol-resistant epithelial ovarian tumors are associated with altered expression of specific beta-tubulin isotypes. J Clin Invest 1997;100:1282-93. 8: Nishio K, Arioka H, Ishida T, Fukumoto H, Kurokawa H, Sata M, Ohata M, Saijo N. Enhanced interaction between tubulin and microtubule-associated protein 2 via inhibition of MAP kinase and CDC2 kinase by paclitaxel. Int J Cancer 1995;63:688-93. 9: Ohta S, Nishio K, Kubota N, Ohmori T, Funayama Y, Ohira T, Nakajima H, Adachi M, Saijo N. Characterization of a taxol-resistant human small-cell lung cancer cell line. Jpn J Cancer Res 1994;85:290-7.