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Página Principal Comunicaciones	EXPRESIÓN TISULAR DE LA COLAGENASA-3 (MMP-13) EN LA COLITIS ULCEROSA Y SU CORRELACIÓN CON LA MORFOLOGÍA DE ESTAS MD Arancha Martin , Dr Francisco Vizoso Piñeiro , MD Luis o Gonzalez Vazquez , MD Richard Gava , MD Mirian Mulero , MD Gabriela Corte y MD Alejandro Andicoechea Servicio de Cirugia General, Medicina Familiar y Comunitaria y Anatomia Patologica del Hospital de Jove. Gijón España
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resumen INTRODUCCIÓN: La colagenasa-3 (MMP-13), aislada y caracterizada por primera vez en el cáncer de mama, es una metaloproteasa que presenta actividad degradativa frente a diferentes elementos de la matriz extracelular y de la membrana basal. OBJETIVOS: Investigar la expresión tisular de la MMP-13 en la Colitis Ulcerosa (CU), los tipos celulares que muestran la expresión, y su relación con las características morfológicas de las lesiones. MATERIAL Y MÉTODOS: Se analizaron un total de 65 biopsias intestinales de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, de las que sólo 35 correspondían a CU y 10 a controles con mucosa de colon normal. Los aspectos morfológicos de las lesiones fueron analizados según los criterios de Riley et al. (Am J Pathol 1998; 153: 121-30). Para la determinación de la expresión de la MMP-13 se utilizó el análisis inmunohistoquímico usando anticuerpos monoclonales. RESULTADOS: Un total de 26 (59,1%) biopsias de CU mostraron una tinción inmunohistoqímica positiva para la MMP-13. Esta inmunotinción se localizó preferentemente en los fibroblastos y en menor proporción se pudo observar también en macrófagos y células epiteliales. En las biopsias de pacientes no afectos por esta enfermedad, así como en la de los controles, no se detectó la expresión de la colagenasa. La expresión de la MMP-13 en la CU estuvo positiva y significativamente asociada con el infiltrado de células polimononucleares (p=0,004) y de mononucleares (p=0,003) en la lámina propia, con la pérdida de la integridad de la superficie del epitelio (p<0,001), de la arquitectura de las criptas (p=0,002) y de células caliciformes (p<0,001). CONCLUSIONES: La MMP-13 es expresada por un porcentaje no significativo de pacientes afectos de CU, y está asociada con una mayor actividad de la enfermedad. De esta manera, el uso de inhibidores de las metaloproteasas podría representar una alternativa terapéutica útil en este tipo de procesos.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Introducción La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino de origen desconocido. En esta entidad existe un típico infiltrado de células inflamatorias que afecta solamente a la mucosa, dando lugar secundariamente a la formación de úlceras. Pero este proceso está asociado con cambios en la proliferación y migración epitelial, así como paralelamente a una intensa remodelación del tejido conectivo subepitelial, capaz de degradar y modificar la pared intestinal. Recientes estudios indican que un disbalance entre la producción de metaloproteasas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs) puede desempeñar un papel importante en la degradación y remodelación de la matriz extracelular que ocurre en la colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn (1-6). La colagenasa-3 (MMP-13) es una MMP aislada y caracterizada por primera vez en el cáncer de mama (7). Se ha demostrado que esta MMP, aunque degrada preferentemente colágeno tipo II, también puede degradar una variedad de componentes de la matriz extracelular, tales como los colágenos tipo IV, X y XIV, fibronectina, tenascina y fibrilina (8-9). Se ha demostrado su expresión, además de en el cáncer de mama, en los carcinomas escamosos de piel(10) y de cabeza y cuello(11), así como de vejiga urinaria(12), melanomas malignos (13) y condrosarcomas(14). Por ello, se considera que su expresión por los carcinomas puede facilitar la invasión tumoral y las metástasis. También se ha descrito la expresión de la MMP-13 en una variedad de procesos inflamatorios, tales como la enfermedad periodontal(15), la artritis (16),silicosis (17) y úlceras intestinales(18). El objetivo del presente estudio ha sido investigar la expresión de MMP-13 en biopsias endoscópicas de pacientes con CU, y su posible relación con el grado de inflamación histológica de las lesiones.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Material y Métodos Biopsias intestinales: En este estudio se incluyeron, de forma retrospectiva, un total de 35 pacientes diagnosticados de colitis ulcerosa (CU). El diagnóstico de esta entidad se hizo en base a criterios clínicos, radiológicos e histológicos estandarizados. La tabla I muestra los datos clínicos y el tratamiento de los pacientes en el momento de la inclusión en el estudio. Todos los pacientes fueron sometidos a una colonoscopia por razones médicas. Las biopsias colónicas fueron obtenidas a través de colonoscopia de áreas afectas (n = 44) o no afectas (n = 6). El grupo control incluyó a 10 pacientes libres de enfermedad inflamatoria intestinal, a los que se les realizó también una colonoscopia por pólipos, vigilancia del cáncer de colon, por investigación de una diarrea persistente o por un síndrome de intestino irritable. Para cada uno de los pacientes se tomó un total de 5 biopsias tanto de zonas afectas como no afectas. Todas las muestras se fijaron en un tampón neutro de formalina al 10% y fueron almacenadas, tras haber sido embebidas en parafina, a temperatura ambiente de 4 meses a 5 años antes de su utilización. Histología y puntuación de inflamación histológica: La tinción de las muestras con hematoxilina-eosina se realizó sobre cortes de 4μm. A todas las muestras se les asignó una puntuación total de inflamación adaptada según los criterios de Riley y cols.19 De acuerdo a estos criterios, se evaluaron seis características histológicas: infiltrado de células polimorfonucleares en la lámina propia, abcesos crípticos, depleción de mucina, integridad de la superficie epitelial, infiltrado de células inflamatorias crónicas (células mononucleares en la lámina propia), e irregularidades en la arquitectura de las criptas. Cada característica histológica, se ordenó de acuerdo a una escala de cuatro ítems: ninguno (0 puntos), leve (2 puntos), moderado (3 puntos) y severo (4 puntos). Además, la puntuación total de inflamación histológica, se graduó de 6 a 24 puntos; de tal manera que el grado final de inflamación será la media de las dos medidas independientes. Purificación de la proteína y obtención de los anticuerpos: La colagenasa-3 se produjo a partir de bacterias recombinantes7. Posteriormente, el anticuerpo se obtuvo mediante la inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda20. Para ello, se inyectaron intradérmicamente y en múltiples zonas, 10μg de colagenasa-3 disuelta en o,5 ml de PBS y emulsionado con igual volumen de adyuvante completo de Freund. Los conejos fueron sangrados a las 6 semanas tras las inyecciones, y el suero dializado a 4ºC durante 24 horas contra tampón fosfato 20mM, pH 7,2. Finalmente, el material obtenido fue cromatografiado en una columna de DEAE-celulosa equilibrada y eluida en el mismo tampón. La fracciones de IgG se conservaron a –20ºC hasta su posterior utilización. Procedimiento inmunohistoquímico: La expresión de MMP-13 se determinó mediante análisis inmunohistoquímico utilizando una dilución de anticuerpos anticolagenasa-3 (1:200). Para llevar a cabo la tinción, se realizaron corte de 5μ de los bloques de parafina, siguiendo el método del polímero conjugado mediante el sistema Envision (Dako, Carpintería, CA, USA). La presencia del enzima fue revelada con diaminobencidina. El proceso de tinción fue detenido mediante lavado con tampón fosfato pH 7,2. Las preparaciones se contrastaron con hematoxilina de Mayer durante 30 segundos y haciéndose virar ésta con agua corriente. Finalmente, las preparaciones fueron montadas en medio permanente Entellan (Merck, Darmstad, Alemania). Las preparaciones histológicas fueron analizadas por dos patólogos independientes sin conocimiento de los datos clínicos del estudio. Las preparaciones fueron consideradas como positivas cuando al menos un 10% de las células tumorales mostraban una tinción inmunohistoquímica positiva para el enzima. Análisis estadístico: Los pacientes fueron subdivididos en dos grupos según los valores de la colagenasa. El grado de inflamación se expresó como la media +/- la desviación estándar. Las diferencias en los valores de la media se calcularon usando el test de la t de Student. La significación estadística se definió cuando p < 0,05.
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Resultados Un total de 26 pacientes (74,28%) diagnosticados de CU mostraban en la biopsia una tinción inmunohistoquímica positiva para la MMP-13 en las zonas afectas. La figura 1 muestra casos representativos de biopsias con una tinción inmunohistoquímica positiva para la colagenasa-3. En las biopsias de mucosa no afecta de los pacientes con esos procesos, así como en la de los controles, no detectó la expresión de la colagenasa. Localización celular de la expresión de la colagenasa-3: Del total de las 26 muestras positivas para la colagenasa-3, la inmunotinción se localizó predominantemente en los fibroblastos en 25 casos (96,15%), en 14 casos en células monocitarias (53,85%) y en 13 casos en células epiteliales (50%). La Tabla II y Figura 1 muestra las diferentes estirpes celulares en las que puede aparecer la colagenasa-3. Relación entre la colagenasa-3 y el grado de puntuación de inflamación histológica: La tabla 3 muestra la relación entre la colagenasa-3 y la puntuación de inflamación histológica. Así, se puede observar que el grado de inflamación histológica es mayor en las biopsias con una inmunotinción positiva para la colagenasa-3 que en las que presentan una inmunotinción negativa para este enzima (p = 0,01). La expresión de MMP-13 estuvo positiva y significativamente asociada con el infiltrado de células polimorfonucleares (p = 0,004) y de mononucleares (p = 0,003) en la lámina propia, con la pérdida de la integridad de la superficie del epitelio (p = 0,002) así como con las células caliciformes (p < 0,001) y las irregularidades en la arquitectura de las criptas. Zoom Figura 1 . Tinción inmunohistoquímica positiva para la colagenasa-3 en A) fibroblastos, B) celúlas mononucleares y C) células epiteliales en mucosa inflamada de pacientes con colitis ulcerosa. Magnificación: X400. Zoom Tabla 1 Características clínicas y tratamiento de los pacientes con colitis ulcerosa en el momento de la inclusión. Zoom Tabla 2 Tipos celulares que muestran tinción inmunohistoquímica positiva para la colagenasa-3 en 26 pacientes con colitis ulcerosa (CU). Zoom Tabla 3 Relación entre la expresión de la colagenasa-3 y la puntuación de inflamación histológica de acuerdo a los criterios de Riley y cols. en 44 biopsias de pacientes con colitis ulcerosa
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Discusión Nuestros resultados demuestran una tinci¨®n inmunohistoqu¨ªmica positiva para la MMP-13 en fibroblastos, c¨¦lulas mononucleares o c¨¦lulas epiteliales en un porcentaje significativo de biopsias endosc¨®picas correspondientes a pacientes con colitis ulcerosa. As¨ª pues, ese hallazgo est¨¢ de acuerdo con los obtenidos por Vaalamo y cols (18) que describe, mediante hibridaci¨®n in situ la expresi¨®n de mRNA de MMP-13 predominantemente en los fibroblastos de las lesiones. Por otra parte nuestros datos demuestran una correlaci¨®n significativamente positiva entre la expresi¨®n de la MMP-13 y el grado histol¨®gico de inflamaci¨®n en las muestras de biopsia. Ello sugiere un papel relevante de la metaloproteasa en la fisiopatolog¨ªa de la enfermedad, probablemente y en combinaci¨®n con otras MMPs, a trav¨¦s de su acci¨®n degradativa de la matriz extracelular. Adem¨¢s, es sabido que en la colitis se liberan una potente cascada de citoquinas que pueden estimular la producci¨®n de MMPs (21). As¨ª, por ejemplo, una de ellas, la interleukina 1¦Â se ha demostrado que tiene la capacidad de estimular la producci¨®n de MMP-13 por los fibroblastos (22). Todo ello sugiere que la inhibici¨®n de las metaloproteasas puede representar una nueva estrategia terap¨¦utica para el tratamiento de esta enigm¨¢tica enfermedad. De hecho, estudios recientes de experimentaci¨®n animal, demuestran un efecto beneficioso de el Batimastato (un inhibidor sint¨¦tico de las MMPs de la matriz) en la colitis experimental en ratas 23).
Subir Resumen Introducción Material y Métodos Resultados Discusión Bibliografia	Bibliografia 1) Von Lampe B, Barthel B, Coupland SE, Riecken E-O, Rosewicz S. Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in colon mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut 2000; 47: 63-73. 2) Baugh MD, Perry MJ, Hollander AP, Rhodri Davies D, Cross SS et al. Matrix metalloptoteinase levels are elevated in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1999; 117: 814-822. 3) Stallmach A, Chan CC, Ecker K-W, Feifel G, Herbst H et al. Comparable expression of matrix metalloproteinases 1 and 2 in pouchitis and ulcerative colitis. Gut 2000; 47: 415-422. 4) Louis E, Ribbens C, Godon A, Franchimont D, de Groote D et al. Increased production of matrix metalloproteinase-3 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by inflamed mucosa in inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol 2000; 120: 241-246. 5) Newell KJ, Matrisian LM, Driman DK. Matrilysin (matrix metalloproteinase-7) expression in ulcerative colitis related tumorigenesis. Mol Carcinog 2002; 34: 59-63. 6) Arihio S, Ohtani H, Hiwatashi N, Torii A, Sorsa T et al. Vascular smooth muscle cells and pericytes express MMP-1, MMP-9, TIMP-1 and type I procollagen in inflamatory bowel disease. Histopathology 2001; 39: 50-59. 7) Freije JM, Díez-Itza I, Balbín M, Sánchez LM, Blasco R, et al. Molecular cloning and expresión of collagenase-3, a novel human matrix metalloproteinase produced by breast carcinomas. J Biol Chem 1994; 269: 16766-16773. 8) Knäuper V, Will H, López-Otín C, Smith B, Atkinson SJ et al. Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation: evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase A (MMP-2) are able to generate active enzyme. J Biol Chem 1996; 271: 17124-17131. 9) Knäuper V, Cowell S, Smith B, López-Otín C, O´Shea M et al. The role of the C-terminal domain of human collagenase-3 (MMP-13) in the activation of procollagenase-3. J Biol Chem 1997; 40: 7608-7616. 10) Airola K, Johanson N, Kariniemi AL, Kahari VM, Saarialho-Kere UK. Human collagenase-3 is expressed in malignant squamous epithelium of the skin. J Investig Dermatol 1997; 109: 225-231. 11) Cazorla M, Hernández L, Nadal A, Balbín M, López- Otín C et al. Collagenase-3 expression is associated with advanced local invasión in human squamous cell carcinomas of the larynx. J Pathol; 186: 144-150. 12) Bostrom PJ, Ravanti L, Reunanen N, Aaltonen V, Soderstrom KO et al. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Int J Cancer 2000; 88: 417-423. 13) Airola K, Karonen T, Vaalamo M, Lohi J, Kariniemi AL et al. Expression of collagenase-1 and -3 correlates with the level of invasion in malignant melanomas. Br J Cancer 1999: 80: 733-743. 14) Uría JA, Balbín M, López JM, Alvarez J, Vizoso F et al. Collagenase-3 (MMP-13) expression in chondrosarcoma cells and its regulation by basic fibroblast growth factor. Am J Pathol 1998; 153: 91-101. 15) Uitto VJ, Airola K, Vaalamo M, Johanson N, Putnins EE et al. Collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) expression is induced in oral mucosa epithelium during chronic inflammation. Am J Pathol 1998; 152: 1489-1499. 16) Wernicke D, Schulze-Westhoff C, Brauer R, Petrow P, Zacher J et al. Stimulation of collagenase-3 expression in synovial fibroblast of patients with rheumatoid arthritis by contact with a three-dimensional collagen matrix or with normal cartilage when coimplated in NOD/SCID mice. Arthitis Rheum 2002; 46: 64-74. 17) Pérez-Ramos J, de Lourdes S, Vanda B, Selman M, Pardo A. Matrix metalloproteinases 2, 9, and 13, and their tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2 in experimental lung silicosis. Am J Respir Crit Care med 1999; 160: 1274- 1282. 18) Vaalamo M, Karjalainen-Lindsberg ML, Puolakkainen P, Kere J, Saarialho_Kere U. Distinct expression profiles of stromelysin-2 (MMP-10), collagenase-3 (MMP-13), macrophage matalloealstase (MMP-12) and tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) in intestinal ulcerations. American Journal of Pathology 1998; 152: 1005-1014. 19) Riley SA, Mani V, Goodman MJ, Dutt S, Herd ME. Microscopic activity in ulcerative colitis: what does it mean? Gut 1991; 32: 174-178. 20) Vaitukaitis JL. Production of antisera with small doses of immunogen multiple intradermal injections. Methods Enzymol 1981; 73: 46-52. 21) Dabiel K Podolsky, MD. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med 2002; 347: 417- 429. Review. 22) Uría JA, Stahle-Bäckdahl M, Seiki M, Fueyo A, López-Otín C. Regulation of collagenase-3 expression in human breast carcinomas is mediated by stromal-epithelial cell interactions. Cancer Res 1997; 57: 4882-4888. 23) Di Sebastiano P, di Mola FF, Artese L, Rossi C, Mascetta G, Pernthaler H et al. Beneficial effects of Batimastat (BB-94), a matrix metalloproteinase inhibitor, in rat experimental colitis. Digestion 2001; 63: 234-239.