| Comunicación Nº: 042 | English version  |
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Marco Masseroli, Francisco O'Valle, Miguel Andújar, Cesar Ramírez, Mercedes Gómez-Morales, Raimundo G. Del Moral.
[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Resultados] [Iconografía] [Bibliografía] [Comentarios]
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Este trabajo describe un nuevo y preciso método automático, basado en el procesamiento de imagen digital, para cuantificar simultáneamente la fibrosis intersticial y la morfología glomerular en una imagen histológica. La fibrosis intersticial es una lesión característica en muchas patologías orgánicas importantes. En el riñón se induce por tratamientos farmacológicos, por patologías primaria del riñon o en el curso de enfermedades sistémicas o procesos degenerativos como el envejecimiento y normalmente precede a las alteraciones de la función renal 1-3, 5. Semejantemente, cambios morfológicos en las estructuras glomerulares (el porcentaje de glomérulos afectados y el grado de las lesiones) son claros marcadores histológicos de una función alterada. Estos cambios se relacionan estrechamente con la fibrosis intersticial 4. Por lo tanto, hay la necesidad obvia de un método fiable y objetivo para cuantificar de forma precisa la magnitud de la fibrosis intersticial en el riñón y el grado relativo y absoluto de alteración morfológica de las estructuras glomerulares.
Entre los métodos morfométricos de cuantificación descritos hasta ahora, las técnicas de recuento de puntos y de análisis de imagen de áreas trazadas manualmente son las más usadas 6-9, 11-15. No obstante, todos los métodos morfométricos requieren mucho tiempo y personal muy entrenado. Por esta razón se usan principalmente en investigación, mientras que las evaluaciones clínicas son todavía realizadas de forma semicuantitativa 29-31.
Un reciente estudio comparativo de análisis morfométricos de estructuras histológicas renales realizados tanto por métodos convencionales que por análisis digital de imagen 10 mostró que ambos métodos son útiles y proporcionan resultados similares por los mismos parámetros. Sin embargo, la técnica digital suministra nuevas informaciones adicionales de parámetros que era previamente imposible evaluar y cuantifica de forma más rápida y más precisa las variables convencionales. Además, la reducción de precio y la creciente potencia de los productos informáticos ahora hace posible incluir programas específicos de análisis de imagen en paquetes de aplicaciones para PC, y así poner las nuevas técnicas en manos de investigadores no necesariamente expertos en el análisis digital de imagen.
El método descrito, que usa la aplicación automática de análisis de imagen Fibrosis HR, es una herramienta rápida, precisa, objetiva y fiable que permite cuantificar parámetros de interés diagnóstico y prognóstico. Los algoritmos automáticos utilizados para segmentar y clasificar las áreas de fibrosis intersticial, flóculo glomerular y matriz mesangial rápidamente producen cuantificaciones exactas y completamente reproducibles sin necesidad de personal especialmente experto en patología. Con la configuración hardware descrita en la sección de Material y Métodos, el tiempo medio de cuantificación es aproximadamente de 14 s/imagen para imágenes sin glomérulos, y varía de 40 s/imagen a 65 s/imagen para la evaluación simultánea de intersticio y glomérulo, dependiendo de la complejidad morfológica del glomérulo.
Recientemente análisis tridimensionales de estructuras glomerulares renales han sido realizadas por reconstrucción seriada de secciones histológicas 15, 32. Sin embargo, las imágenes bidimensionales usadas por los algoritmos de reconstrucción fueron segmentadas manualmente, y a causa del grande número de secciones requerido para la evaluación tridimensional, este método requiere mucho tiempo y resulta aplicable sólo en estudios experimentales aislados. Con nuestro método se segmentan automáticamente imágenes de secciones glomerulares y se produce una imagen binaria de cada estructura glomerular extraída. Así, los algoritmos en nuestra aplicación de análisis de imagen pueden ser usados para accelerar los análisis bidimensionales previos a evaluaciones tridimensionales.
Aunque usamos un software específico (Visilog 4.1) para desarrollar nuestra aplicación de análisis de imagen, los principios y las soluciones sugeridas son extrapolables a otros sistemas. La tinción usada (rojo Sirio) se escogió por su reproducibilidad, estabilidad, y escasos artefactos y tinción de fondo 33. De cualquier modo, la aplicación de análisis de imagen Fibrosis HR puede cuantificar rasgos también en secciones inmunoteñidas con anticuerpos mono- o policlonales contra colágena, laminina, fibronectina u otras moléculas intersticiales detectables con los métodos de estreptavidina-biotina fosfatasa alcalina o peroxidasa. La cuantificación de estas técnicas inmunohistoquímica mejoraría seguramente con el uso de inmunoteñidores automáticos.
Se conoce que el rojo Sirio tiñe todos los constituyentes del intersticio en general, incluido el colágeno IV componente de las membranas basales glomerulares y peritubulares 33. Éste hecho no invalida nuestro método, sino que hace nuestra técnica más útil. Se ha mostrado que a nivel glomerular y en patologías intersticiales específicas (diabetes, nefronoptisis, etc.) estos cambios en la membrana basal preceden al desarrollo de esclerosis glomerular e intersticial 31, 34, 35. Dado que nuestro procedimiento recoje los datos morfológicos correspondientes a la identificación y aislamiento de las membranas basales, es capaz de estimar los leves cambios producidos inicialmente. Estos cambios no se pueden detectar en imágenes capturadas con luz polarizada, un método propuesto por Moreso et al. 17.
Aunque el rojo Sirio sea una tinción estable usada de rutina para estructuras intersticiales y glomerulares en el riñón 17, 36, diferencias en la intensidad de tinción pueden ocurrir en secciones de tejido de diferentes lotes. A causa de la falta de un estándar para la intensidad de tinción del rojo Sirio, la normalización automática de la iluminación de captura de imagen no es posible hoy por hoy. Normalmente, esta operación se realiza manualmente y se eligen visualmente los valores de iluminación que dan las mejores imágenes digitales 16, 36. Esto puede llevar a diferencias subjetivas. Para asegurar la objetividad y reproducibilidad de la definición de los valores de iluminación de captura de imagen, desarrollamos una función de control captura y evaluamos la reproducibilidad intra- e interobservadores de la adquisición de imagen. Los resultados demuestran que sin la función de control de captura hay variabilidad subjetiva en la definición visual de la mejor iluminación de captura. Además, el rango de valores de iluminación mejores puede incluir valores que llevan a diferencias significativas en la cuantificación de la imagen. En cambio, el uso de la función de control de captura reduce el rango de valores mejores de iluminación y provee completa reproducibilidad intraobservador. Por lo tanto, para evitar posibles diferencias de cuantificación debidas a la adquisición de la imagen, sugerimos que el mismo operador capte todas las imágenes del mismo experimento usando la función de control de captura para definir la intensidad de la iluminación de captura.
El aislamiento correcto de las áreas de fibrosis intersticial y matriz mesangial es el paso más difícil en la cuantificación del tejido renal. Hasta ahora, la segmentación ha sido realizada manualmente 7, 11, 14, principalmente a causa de la ausencia de una tinción específica para la fibrosis y matriz mesangial, y la dificultad de llevar a cabo métodos automáticos capaces de extraer y diferenciar la fibrosis de otras estructuras tubulares inespecíficamente teñidas. Sin embargo, los métodos manuales requieren mucho tiempo y son sujetivos, sobre todo en situaciones patológicas donde la complejidad de la estructura de la imagen puede llevar operadores diferentes a adoptar diferentes estrategias de segmentación.
Un método automático recientemente desarrollado para cuantificar el intersticio renal supera el problema de la segmentación aplicando funciones de morfología matemática a la imagen en niveles de gris 17. El nivel de información obtenido con este método de análisis global puede ser útil para evaluar diferencias entre sujetos y definir relaciones entre parámetros morfométricos y de función renal a través de algoritmos basados en la inteligencia artificial 17. No obstante, este método presenta varios problemas: a) dado que analiza imágenes de tinción de rojo Sirio captadas con luz polarizada, se pierde información sobre las membranas basales peritubulares; b) dado que sólo se aplica a imágenes intersticiales, no se puede evaluar la matriz mesangial glomerular o la fibrosis periglomerular; c) dado que provee un índice global de evaluación de la imagen, no permite cuantificar las diferentes áreas de imagen en unidades métricas, ni establecer relaciones estadísticas individuales de estas con otras variables.
El algoritmo automático que desarrollamos, basado en la umbralización automática de Kurita y en un algoritmo de filtraje morfológico, puede segmentar y clasificar áreas de fibrosis y matriz mesangial entre otras estructuras renales con las mismas características densitométricas. Dado que las estructuras morfológicas se aíslan y se conservan, se pueden evaluar inmediatamente los resultados de la segmentación y cuantificación, en unidades métricas, de ambos componentes morfológicos intersticiales y glomerulares. La validación estadística demuestra que las áreas de fibrosis y de matriz mesangial estan segmentadas fielmente por el algoritmo descrito, mientras que el procesamiento automático asegura la objetividad y reproducibilidad de los resultados de cuantificación.
El área glomerular se identifica fácilmente en glomérulos quísticos y normales, pero esta tarea es más difícil en glomérulos esclerosados. Se pueden usar algoritmos automáticos de reconocimiento de rasgos de imagen para identificar la región glomerular en glomérulos quísticos o normales 37, 38. Sin embargo, es improbable que la elaboración automática pueda segmentar correctamente glomérulos esclerosados, mientras que el aislamiento interactivo puede producir resultados aceptables. Heudes et al. 16 recientemente publicaron resultados de cuantificaciones de estructuras morfológicas glomerulares obtenidos con un método automático de análisis de imagen basado en la morfología matemática. Desgraciadamente, no se dio ninguna característica técnica del algoritmo de procesamiento de imagen. Además, el método podía analizar sólo glomérulos en los que la matriz mesangial, las secciones de luces capilares y los espacios uriníferos fuesen claramente distinguibles, y era incapaz de evaluar glomérulos que presentaran retractación del flóculo o algún grado de glomerulosclerosis. Para asegurar que nuestro algoritmo es capaz de cuantificar rápida y constantemente tejidos renales en varias condiciones, decidimos identificar el área glomerular con un simple paso interactivo (ver Material y Métodos). El análisis estadístico no desveló ninguna diferencia significativa intra- ni interoperadores en la identificación interactiva del área glomerular. Este resultado demuestra que nuestro algoritmo para la identificación del área glomerular, el único paso interactivo de nuestra aplicación de análisis de imagen, no introduce variabilidad significativa y por lo tanto se puede usar para la cuantificación objetiva y reproducible de la fibrosis intersticial y de la morfología glomerular.
Los porcentajes definidos para el flóculo glomerular (PAFG y PAFGt) dieron los mismos resultados estadísticos. Como en el caso de los porcentajes del área de fibrosis intersticial y de matriz mesangial, el análisis estadístico mostró una variabilidad significativa interoperadores en la segmentación manual de las áreas de flóculo glomerular para todas las condiciones morfológicas glomerulares consideradas. Esto demuestra que las cuantificaciones obtenidas con segmentación interactiva resultarían parcialmente subjetivas y no reproducibles. El algoritmo automático descrito usa una nueva combinación de la umbralización automática de Kittler e Illingworth con los resultados de la segmentación obtenida con la umbralización automática de Kurita y genera segmentaciones reproducibles del flóculo glomerular. La validación estadística demostró la exactitud de estas cuantificaciones tanto en glomérulos normales como patológicos.
En nuestra evaluación de los dos porcentajes de área de flóculo glomerular definidos (PAFG y PAFGt) para diferenciar entre condiciones morfológicas glomerulares diferentes, el análisis estadístico mostró que sólo PAFG varía significativamente para condiciones glomerulares diferentes. Así que PAFG puede ser usado para clasificar glomérulos según su apariencia morfológica. Además, es importante resaltar que las diferencias resultaron significativas aun cuando ninguno de los glomérulos estaba completamente esclerosado, oscilando desde simples sinequias hasta esclerosis parcial con o sin semilunas. Esto sugiere que PAFG puede ser usado para definir grados diferentes de glomerulosclerosis, lo cual representa una importante mejora en la evaluación de la morfología glomerular. Además, PAFG es un parámetro objetivo potencialmente útil en el seguimiento clínico de la glomerulosclerosis o en modelos experimentales in vivo.
En conclusión el presente trabajo ilustra y discute un nuevo método automatizado, basado en una aplicación original de procesamiento de imagen, Fibrosis HR, que permite rápidas cuantificaciones de la fibrosis intersticial y de la morfología glomerular. Los estudios de validación de todas las partes del método demostraron que la aplicación de análisis de imagen produce cuantificaciones objetivas, totalmente reproducibles, precisas y fiables. Por lo tanto, este método puede ayudar a mejorar la valoración morfológica de las patologías intersticiales y glomerulares.
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