| Comunicación Nº: 042 | English version  |
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Marco Masseroli, Francisco O'Valle, Miguel Andújar, Cesar Ramírez, Mercedes Gómez-Morales, Raimundo G. Del Moral.
[Título] [Introducción] [Resultados] [Iconografía] [Discusión] [Bibliografía] [Comentarios]
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Los riñoñes de las ratas, abiertos por un corte sagital, se fijaron en formalina tamponada al 4% en PBS, se incluyeron en parafina y se cortaron a 4 µm de espesor. Para mejorar la tinción, después de desparafinar, las secciones de tejido se mantuvieron durante 3-5 días en alcohol al 70% como mordentaje y sucesivamente se tiñeron con rojo Sirio-ácido pícrico F3BA (Gurr, BDH Químicos Ltd., Poole, UK) al 1%. El rojo Sirio tiñe las fibras conectivas de un color rojo intenso y los núcleos y citoplasmas de las células tubulares de rojo débil y amarillo brillante 18.
Las imágenes fueron captadas con una vídeo cámara CCD en blanco y negro (Vidamax CCD BCD-700) acoplada a un microscopio Olympus BH-2 (Olympus Optical Co. Ltd., Tokio, Japón) con un adaptador Olympus MTV-3. La utilización de una lente intermedia y de un objetivo de 20X proporcionó un aumento total de 200X. Las imágenes analógicas fueron captadas con un filtro óptico verde IF 550 y digitalizadas con 8 bits de resolución de intensidad luminosa (256 niveles de gris). El tamaño óptico de la imagen fue de 44221.34 µm² para una imagen de 256x256 pixeles cuadrados, con una resolución óptica de 0.67 µm² / pixel.
Para corregir la potencial variabilidad de la intensidad de coloración de los diferentes lotes de tinción, se fijaron y calibraron todos los parámetros de captación de imagen y la intensidad de iluminación de captura tan sólo ajustando la abertura del condensador del microscopio.
Para optimizar la calibración de la intensidad de iluminación de captura y su reproducibilidad, se usó una función de control de captura específicamente implementada y que se describe en el apartado Digitalización y Preelaboración de Imagen. El enfoque se ajustó manualmente, un solo plano de enfoque para cada 4 µm de espesor de sección histológica resultó adecuado para el análisis
El sistema de análisis de imagen constó de un PC con procesador Pentium-S (Intel Corporation, Santa Clara, CA, EE.UU.), 16 Mbytes de memoria RAM, disco duro de 1 Gbyte, tarjeta gráfica S-VGA, tarjeta MVP-AT (Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Canadá) con 1 Mbyte de memoria RAM para la captura y el procesamiento de las imágenes, un monitor RGB GVM-1411QM (Sony Corporation, Tokio, Japón) de alta resolución y un monitor RGB MF-5117 (Iiyama Electric Corporation Co., Tokio, Japón) de 17 pulgadas.
El procesamiento de imagen se realizó bajo MS-DOS 6.20 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE.UU.) en ambiente MS-Windows 3.11 (Microsoft), a través de algoritmos originales realizados utilizando el programa Visilog 4.1 (Noesis S.A., Velizy, Francia) para el desarrollo de programas de análisis de imagen, y reunidos en una aplicación de análisis de imagen llamada Fibrosis HR.
La Figura 1 muestra los componentes principales de Fibrosis HR, el programa de análisis de imagen desarrollado para cuantificar automáticamente la fibrosis intersticial y la morfología glomerular en secciones histológicas renales. Después de un paso preliminar en el que es inicializa el sistema, se carga la escala geométrica y se definen las condiciones de adquisición y medición, el programa se consta de tres partes: 1) digitalización y preelaboración de la imagen digital, 2) procesamiento de la imagen preelaborada, y 3) análisis de la imagen procesada y medición de parámetros.
Imágenes histológicas de secciones renales teñidas con rojo Sirio y digitalizadas en blanco y negro como se describió anteriormente, fueron captadas con intensidad de iluminación un poco superior de la utilizada por la observación normal. Esto produce imágenes con exceso de luz y reduce la influencia en la imagen digital de los elementos ligeramente teñidos por el rojo Sirio y carentes de interés para la evaluación intersticial y glomerular (p.e, citoplasmas y núcleos de las células tubulares) sin modificar las áreas fibróticas teñidas (Figs. 2 A y C). Este procedimiento proporciona mejores resultados en la segmentación automática de las áreas de fibrosis intersticial.
Para optimizar la reproducibilidad de los valores de intensidad de iluminación de captura, se desarrolló una función de control de captura de imagen. Esta función muestra al usuario la imagen digital captada y el resultado de su umbralización automática superpuesto.
Para eliminar las interferencias causadas por una iluminación irregular o aberraciones de la lente de la cámara, se realizó un "shading correction" de la imagen digital comparando pixel por pixel la imagen digitalizada con una imagen de fondo previamente captada. Sucesivamente la imagen se normaliza expandiendo su histograma de niveles de gris a todo el rango de niveles disponibles 19.
El proceso de preelaboración proporciona imágenes con características homogéneas, independientemente de sus condiciones de digitalización. Esto hace posible aplicar técnicas de umbralización automática a las áreas teñidas intensamente por el rojo Sirio. Segmentación, identificación y clasificación de los elementos de interés en la imagen son obtenidos a través de una sucesión original de operaciones de procesamiento de imagen que constan de: 1) umbralización automática de los niveles de gris para segmentar las áreas teñidas intensamente por el rojo Sirio, utilizando el método del umbralización global de Kurita 20, 2) un algoritmo automático de filtraje morfológico para extraer las áreas de fibrosis intersticial y de matriz mesangial (Figs. 2 B, D y F), y 3) operaciones lógicas y de morfología matemática 21, 22 para aislar la región glomerular y el flóculo glomerular (Figs. 2 E, 2 G, 2 H y 3 A - H).
En este apartado todos los elementos de interés en la imagen, aislados y clasificados con el procesamiento de imagen, se miden automáticamente y se muestran superpuestos a la imagen preelaborada inicial para visualizar inmediatamente la precisión de la segmentación (Fig. 2). Así, el área de fibrosis intersticial (AF), el área glomerular (AG), el área de matriz mesangial (AM) y el área de flóculo glomerular, con (AFGt) y sin (AFG) luces capilares y espacios entre segmentos floculares, se cuantifican en µm². Además sus valores en porcentaje se calculan como sigue:
Todos los datos se guardan en archivos ASCII de datos, donde cada línea se refiere a una imagen evaluada y contiene el nombre de la imagen y los valores de todos los parámetros cuantificados. Esta organización facilita el manejo de los datos y su exportación a programas externos para su evaluación estadística. Además, por cada sección del tejido evaluada se genera automáticamente un fichero de informe; este contiene para cada parámetro la media aritmética de sus valores en todas las imágenes evaluadas.
Para determinar precisión, objetividad y reproducibilidad del método de análisis de imagen desarrollado, se analizaron sus partes principales. Específicamente evaluamos:
La exactitud y fiabilidad de los resultados automáticos fueron validadas comparándolos con valores estándar de referencia obtenidos sobre el mismo grupo de imágenes por evaluación manual de varios operadores.
Para comprobar la reproducibilidad intra- e interoperadores en la determinación de la iluminación de captura de imagen, se consideró una sucesión de 55 imágenes sin glomérulos del mismo campo de corteza renal de rata aumentando ligeramente la abertura del condensador del microscopio cada cinco imágenes (con cinco replicaciones para la misma abertura) y se preelaboraron como ya se ha descrito. Todas las imágenes fueron evaluadas visualmente por cuatro observadores. Cada observador definió dos veces el rango de aberturas del condensador del microscopio para eligir las mas apropiadas para la evaluación automática. El acuerdo entre las evaluaciones visuales se determinó estadísticamente (ver Análisis Estadístico). Todas las imágenes fueron también evaluadas automáticamente usando la aplicación de análisis de imagen. Los resultados de porcentaje de área de fibrosis se compararon estadísticamente para determinar el rango de aberturas del condensador del microscopio que dieron porcentajes de áreas de fibrosis sin diferencias significativa (ver Análisis Estadístico).
La eficacia de la función de control de captura en mejorar la objetividad y reproducibilidad de la definición de la abertura óptima del condensador se probó replicando la evaluación visual. Cada observador analizó las mismas imágenes con el resultado de su umbralización automática superpuesto, proporcionado por la función de control de captura.
La segmentación automática se validó en un total de 20 imágenes normales y 20 patológicas, con y sin glomérulos, digitalizadas al azar en varios cortes de corteza renal de rata. Cada uno de los dos grupos de imágenes normales y patológicas incluía 10 imágenes con y 10 sin glomérulo. Las imagenes fueron seleccionadas por consenso entre dos patólogos. Áreas de fibrosis intersticial y matriz mesangial en las 40 imágenes fueron umbralizadas manualmente con cinco replicaciones en cinco días diferentes por cinco operadores independientes y expertos en la evaluación visual de la fibrosis renal y en el uso del ordenador. Los resultados de porcentaje de áreas de fibrosis y de matriz mesangial se evaluaron estadísticamente para determinar la variabilidad intra- e interoperadores en la segmentación manual de estas áreas (ver Análisis Estadístico). Además, para cada imagen se calculó la media de los resultados de todos los operadores para determinar valores estándar de referencia para la umbralización manual media. Para evaluar la exactitud del método automático propuesto, los valores de porcentaje del área de fibrosis y del área de matriz mesangial obtenidos para las mismas imágenes con la umbralización automática de Kurita fueron comparados estadísticamente con los valores estándar de referencia para la umbralización manual media y con los valores de otros tres métodos globales de umbralización automática seleccionados que produjeron segmentaciones visualmente parecidas a las obtenidas con la umbralización manual de Kurita. De estos tres métodos los dos primeros (de Kittler e Illingworth 23 y de Kittler e Illingworth con distribución de Poisson de los niveles de gris de la imagen 24) determinan el umbral mejor entre dos poblaciones en el histograma de niveles de gris de la imagen minimizando una función criterio que representa la superposición de las dos poblaciones (el "error de umbralización"). El tercer método (método isodata corregido) es un proceso iterativo aplicación directa del algoritmo de "clusterización isodata" 25, 26 en el cual el valor del umbral de isodata se corrige con un factor proporcional al rango de niveles de gris en la región más clara definida por él mismo umbral de isodata.
Para evaluar la reproducibilidad intra- e interoperadores en la realización del sólo paso interactivo de la aplicación de análisis de imagen, usamos las mismas 20 imágenes con glomérulos consideradas en la validación de la umbralización. Las áreas glomerulares en estas imagenes se identificaron por los mismos cinco operadores expertos e independientes cinco veces en cinco días diferentes (ver Procesamiento de Imagen). Los valores de área glomerular obtenidos se analizaron estadísticamente (ver Análisis Estadístico).
Para validar la segmentación automática de las áreas de flóculo glomerular teñidas por el rojo Sirio, consideramos 30 imágenes con glomérulos digitalizadas al azar en varios cortes de corteza renal de rata. Las áreas de flóculo glomerular de 10 glomérulos normales, 10 quísticos y 10 esclerosados (según consenso de dos patólogos) fueron umbralizadas manualmente cinco veces en cinco días diferentes por cinco operadores independientes expertos en la evaluación visual de las patologías renales y en el uso del ordenador. Los resultados de porcentaje de área de flóculo glomerular se evaluaron estadísticamente, como descrito en Análisis Estadístico, para determinar su variabilidad intra- e interoperadores. Además, se calculó para cada imagen la media de los resultados generados por todos los operadores para determinar un valor estándar de referencia para su umbralización manual. Para evaluar la exactitud del método automático propuesto, los porcentajes de área de flóculo glomerular obtenidos con el procesamiento automático de las mismas imágenes se compararon estadísticamente con los valores estándar de referencia para la umbralización manual media. Para evitar diferencias inducidas por la selección de diferentes áreas glomerulares, en todas las evaluaciones automáticas y manuales el área glomerular considerada para cada imagen fue siempre la misma y correspondió al área segmentada por el primer operador en su primera evaluación.
Para probar la capacidad discriminante entre condiciones morfológicas glomerulares diferentes de los dos valores definidos de porcentaje de área flocular, analizamos las mismas 30 imágenes empleadas para validar la umbralización automática de las áreas de flóculo. Los porcentajes del área del flóculo glomerular, con y sin luces capilares y espacio urinífero entre los segmentos floculares, se agruparon por condición glomerular (glomérulos normales, quísticos y esclerosados) y se analizaron estadísticamente (ver Análisis Estadístico).
Los datos se analizaron con el software BMDP (Universidad de California, Los Angeles, CA, EE.UU.). Todos los valores se obtuvieron de imágenes captadas al azar en varios cortes diferentes de corteza renal de rata.
Antes de cada prueba estadística se verificó la normalidad de la variable con la prueba W de normalidad de Shapiro y Wilk 27. Cuando la variable no mostró una distribución normal, la normalidad se aseguró por transformación logarítmica de los datos.
Para determinar la reproducibilidad intra- e interoperadores en la determinación de la iluminación de captura de imagen y la eficacia de la función de control de captura, las evaluaciones de cada pareja de operadores se analizaron calculando su porcentaje de acuerdo (PA). El acuerdo global medio intra- e interoperadores se cuantificó calculando media (µ), desviación estándar (DE) y coeficiente de variabilidad (CV = DE / µ) de los valores de PA.
Para evaluar los rangos de aberturas del condensador del microscopio que proporcionan imágenes sin diferencias significativas con la evaluación automática, fueron analizados estadísticamente con el test de ANOVA de una vía, usando abertura del condensador del microscopio como factor, los porcentajes medios de área de fibrosis en imágenes captadas con 11 diferentes aberturas del condensador del microscopio comprendidas en el rango 0.30 - 0.40. El ANOVA fue seguido por la prueba de Tukey para comparaciones de múltiples grupos.
La variabilidad intra- e interoperadores en la segmentación manual de las áreas de fibrosis, matriz mesangial, glomerular y flóculo glomerular se determinó con el test de ANOVA de dos vías usando la replicación y el operador como factores 28. En todos los casos el ANOVA fue seguido por la prueba de Tukey para comparaciones de múltiples grupos.
La exactitud del método propuesto en segmentar automáticamente las áreas de fibrosis y matriz mesangial se probó comparando los valores medios de estas variables obtenidos manualmente con los resultados obtenidos de forma automática. ANOVA de una vía (considerando el método como factor) fueron seguidas por las pruebas de Dunnett para comparar múltiples grupos frente a un grupo estándar.
La exactitud del método en segmentar automáticamente el flóculo glomerular se determinó usando las pruebas del t de Student para comparar porcentajes medios de áreas de flóculos hallados manualmente con los resultados de la umbralización automática de Kittler e Illingworth.
La eficacia de los porcentajes de área de flóculo glomerular definidos en discriminar entre diferentes condiciones morfológicas glomerulares se evaluó analizando los porcentajes con el test de ANOVA de una vía, usando la condición morfológica glomerular como factor. Los test de ANOVA fueron seguidos por las pruebas de Tukey para comparaciones de múltiples grupos.
En todas las pruebas las diferencias se consideraron significativas cuando p<0.05.
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