Fig. 6. Equipo de citometría estática
La CITOMETRIA ESTATICA realiza estudios de ploidia y otros de morfometría de los diversos orgánulos celulares (Fig 6). Las células son teñidas habitualmente con el método de Feulgen que consigue una unión estequiométrica con el DNA nuclear. Lo mejor es proceder sobre extensiones que son directamente pensadas para estudio morfométrico en las que se unan al cristal mediante secado en cámara de desecación y con poli-L-lisina. A esa extensión se le debe hacer una destrucción de los citoplasmas con pepsina y una permeación del DNA mediante destrucción de histonas y proteínas de la matriz nuclear y finalmente tinción con el reactivo de Schiff del Feulgen. Lo ideal es utilizar reactivo recién preparado. El estudio de la ploidia lo hacemos al menos en 200 núcleos de células con características morfológicas neoplásicas. El histograma se compara con controles externos como pueden ser hematíes de pollo y de carnero y controles internos que pueden ser linfocitos existentes en la preparación que estamos estudiando. El programa Texcam tiñe con hematoxilina progresiva, no lo hemos utilizado, pero un requisito imprescindible en este método es alcanzar la experiencia de detener la tinción nuclear en el punto justo.
Fig. 6. Equipo de citometría estática
En el análisis de imagen , un vídeo recoge desde la preparación los datos correspondientes morfométricos que son analizados prácticamente en tiempo real mediante un ordenador habitualmente un simple PC. Nos informa por la luz absorbida de la textura (citodensitometría) y de las medidas celulares (citomorfometría). En la citometría estática los extendidos celulares deben estar en monocapa y las células separadas unas de otras. Iniciamos el estudio buscando áreas de la preparación en que las células reúnan las condiciones técnicas citadas de disposición individual y en monocapa. A continuación sometemos la imagen a algunas transformaciones para ser mejor vista por la máquina. Para ello actuamos con los llamados OPERADORES LOCALES o FILTROS DIGITALES. Hay dos clases de filtros, el de paso bajo y el de paso alto. El primero selecciona en la imagen los niveles relativamente próximos de grises y desprecia o no deja pasar la gama de grises de valores extremos muy disonantes que suelen corresponder a solapamiento de imágenes multibanda o cúmulos artefactuales. A esta operación también se le denomina eliminar "ruido" de la imagen. Los filtros de paso alto tratan de aumentar los límites de los elementos a estudiar. Para ello incrementan la diferencia entre la imagen y las zonas adyacentes resaltando el borde por ejemplo del contorno nuclear.
A continuación tenemos que decidir cuales elementos no deben ser tenidos en cuenta en el estudio. Por ejemplo si estamos valorando una técnica cual es el nivel considerado como tinción positiva. Para ello tenemos que decidir un UMBRAL o valorar límites dentro de los cuales se va a realizar el estudio. Fuera de este umbral la posible información es tratada como ruido. En esquema los pixeles que nos interesan los pasamos a blanco y los que depreciamos lo fundimos en negro. A este proceso se llama SEGMENTACION de la imagen puesto que separa los componentes de la imagen que van a ser estudiados. La segmentación puede ser interactiva, eligiendo los objetos el observador, automática decidiéndolo la máquina o bien semiautomáticas en la que podemos incluir o quitar algunas células además del procesado automático. La EROSION consiste en quitar la capa de pixeles de la superficie del objeto a medir y así se alisa la superficie aunque el fin último suele ser aislar células en contacto lo que permitirá su medida individual. La DILATACION es lo opuesto, consiste en añadir una capa de pixeles a la superficie del objeto a analizar. Si hacemos una o más erosiones seguida de igual número de dilataciones no conseguimos obviamente la imagen inicial, a este proceso se llama "opening" y al contrario "closing", es decir, dilataciones y después erosiones. La ESQUELETIZACION de las imagenes se consigue estrechándolas hasta quedarlas en una línea. Esqueletos lineales nos indican formas simples, ovoideas o elipses y esqueletos ramificados corresponden a estructuras complejas.
La mayor DIFERENCIA de la citometria estática con la de flujo está en el hecho de que elige las células . Esto la hace más lenta pero es más sensible, encontrando más picos aneuploide sobre todo muy cercanos al G0/G1. Esto es muy importante porque el material a estudiar para citometria de flujo debe ser muy cuidadoso para incluir tumor y no zonas inflamatorias o de estroma. Incluso puede ocurrir que tumores con abundante estroma produzcan un falso resultado de benigninidad o diploidia en la citometria de flujo. ( Figs. 7 y 8 ) Sin embargo hay que tener en cuenta que en las secciones para citometria estatica hay núcleos cortados y su medida no corresponde a todo el núcleo. También es criticada por algunos en los resultados de la investigación de la proliferación celular por citometria estatica porque consideran que el numero de células estudiado, 200, es poco representativo. Además este estudio debe ser efectuado por personas con conocimientos morfológicos. Pero por otra parte los histogramas de citometría de flujo tetraploides plantean problemas de interpretación. Pues las células tumorales tetraploides se disponen como dobletes de células diploides G1 y sobrepuestas a las células normales G2 y M. El pico G2/M es habitualmente el 10% pero se admite hasta el 35% lo que puede ocultar tumores tetraploides, por ello muchos autores consideran a estos histogramas tetraploides. Pero también es cierto que dobletes de células diploides con alta adhesividad celular pueden en la citometría de flujo ser contabilizadas en el pico G2/M. Por otra parte muestras con muchas células benignas y pequeña cantidad de células aneuploides pueden no ser detectadas en esta técnica. Además entre los núcleos investigados se incluyen elementos del estroma, inflamatorios, vasculares, de necrosis, etc. Algunos artificios técnicos se han realizado para obviar este impedimento.
Sin embargo se tiene ya suficiente experiencia de las dos técnicas y de los grados de correlación entre ambas. Es aconsejable si se tienen las dos y hay abundante material celular, empezar por la más rápida, la citometría de flujo y si los histogramas que se obtienen son aneuploides se da por acabado el estudio, pero si son diploides debe hacerse citometría estática dado que aquella no descubre algunos picos aneuploides que encuentra ésta.
