J. FARIÑA GONZALEZ Y MC. MILLANA DE YNES
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La reacción en cadena de la polimerasa es considerada la técnica más revolucionaria de los últimos veinte años. Con ella se consiguen millones de copias de una secuencia específica de ADN en pocas horas. La cantidad necesaria de ADN, en principio necesitaría sólo una molécula de ADN, aunque habitualmente se toman cantidades alrededor de un microogramo. La molécula de ADN es muy estable, por lo que puede ser recogida generalmente, sin métodos purificadores, a partir de productos biológicos diversos, como tejidos frescos, incluidos en parafina, esperma, lavados bronquiales, material de mucosas tomado con torunda, pelos, sangre, extendidos citológicos, material desecado de momias, entre otros.
La técnica de PCR fue descubierta en el año 1983 por Kary Mullis y por ella le fue concedido el premio Nobel. Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN. Está basado en la acción de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN, y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menos una pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis. Esto hace posible, si de forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que sean complementarios de una porción, se unirá después de la desnaturalización de la doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de los nucleótidos correspondientes suministrados y, a través de la acción de la polimerasa, se hace la amplificación del fragmento deseado.
En esencia un ciclo de amplificación está constituido por tres reacciones que se hacen a temperaturas distintas.
La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno a una temperatura de 95º C (figura 1).
Figura 1. Desnaturalización del ADN.
La segunda reacción consiste en la hibridación de estas cadenas con los denominados oligonucleótidos iniciadores o primers, que son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del ADN. Para ello bajaremos la temperatura y las condiciones serán tales que sobre todo facilitaremos la unión de los primers a las cadenas. Estos iniciadores no deben ser complementarios entre sí, para que no se hibriden entre ellos, y deben corresponder a los extremos de la porción de DNA que queremos amplificar. Esta reacción suele hacerse alrededor de 50 y 80º C que se calcula mediante una formula sencilla, Tm = 4(nº de pares GC) + 2(nº de pares AT) (figura 2).
Figura 2. Hibridación con anillamiento de los cebadores.
La tercera reacción se efectúa a los 72º C, temperatura a la que, la polimerasa lleva a cabo su acción, concretamente la Taq DNA polimerasa que va actuar engarzando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde (figura 3).
Figura 3. Polimerización por actuación de la Taq polimerasa.
Para hacer la reacción se debe de aportar: el ADN a copiar, en cantidad habitual de un microgramo, los primers, o cebadores, que se anillarán a las cadenas simples de DNA, grandes cantidades de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos necesarios para el DNA a amplificar (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), la Taq DNA polimerasa, que es la enzima de la bacteria de las aguas termales denominada thermus aquaticus, que ya vive a más de 70ºC y su temperatura óptima e actuación es a 72ºC, pero es estable a temperaturas superiores a 90ºC, que son necesarios para realizar la desnaturalización. La utilización de esta enzima ha permitido la automatización de la PCR, porque se puede suministrar desde el principio todos los elementos en un mismo tubo de ensayo. Esto hace que lo que se tenga que realizar es una primera subida a 95º durante cinco minutos para desnaturalización, una bajada a 50º ó 80º un minuto, para que se produzca el anillamiento de los primers o iniciadores y una subida de nuevo, pero ahora a 72º, para que se produzca la extensión hacia el extremo 3` del DNA amplificado. Estas tres reacciones constituyen un ciclo. Normalmente se realizan 30 ó 40 ciclos en los cuales los fragmentos de cadena de ADN pequeños, los situados entre los primers, se habrán amplificado mucho más en número que los de cadena larga iniciales.
Una vez que hemos sintetizado in vitro una secuencia de ADN debemos reconocerla. Para detectar el producto lo podemos hacer pos diversos métodos. Uno de los más frecuentes es mediante la actuación con enzimas rectrictasas que rompen el ADN en fragmentos de diferentes tamaños. A continuación pondremos estos fragmentos en un gel de agarosa en el que haremos que se desplacen mediante electroforesis. Para visualizar el ADN en el gel se le añade bromuro de etidio que fluorece con luz ultravioleta. Se utilizan controles de pesos moleculares conocidos que permiten reconocer los fragmentos sintetizados. En todos los casos se deben incluir controles negativos para detectar contaminaciones. Los materiales biológicos habitualmente para hacer la PCR se fijan en formol tamponado o en alcohol de 95º.
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