En la actualidad, la nueva generación de MO que controlan de forma constante la temperatura (± ½ ºC), hasta para sustancias no polares como la parafina o el xileno y que disponen de sistemas antiburbujas permiten la realización rápida de fijación e inclusión de tejidos en parafina y en resinas, desenmascaramiento antigénico más controlado, aceleración de tinciones histoquímicas e inmunohistoquímicas incluida la técnica con oro coloidal, hibridación in situ y amplificación de ADN.
Objetivo: El propósito de esta comunicación es aportar nuestra experiencia en la utilización de los HMO de la última generación para el manejo de las biopsias que requieren un procesamiento acelerado y destacar distintos protocolos y procedimientos de fijación, inclusión y tinción de las muestras tisulares.
Material y métodos: Para el procesamiento de las biópsias empleamos un horno microondas de última generación Energy Beam Sciences Inc. modelo H2800/2 con una potencia de 1800 vatios (Vitro-Imico, España). Las muestras fueron cilindros y cuñas renales con sospecha de rechazo agudo o procedentes de riñones de donantes añosos.
Resultados: Mediante la utilización de este tipo de hornos es posible acelerar la inclusión de pequeñas muestras de tejido hasta tan solo una hora, así como reducir enormemente los tiempos de incubación de las técnicas más habituales en patología renal diagnóstica como es el caso del PAS, tricrómico de Masson, plata metenamina, etc. Se discuten y comentan los protocolos técnicos que empleamos y las posibilidades técnicas en los laboratorios de anatomía patológica de los nuevos HMO.
Microondas, Fijación, Inclusión, técnicas histoquímicas.
El horno de microondas (HMO) es una cavidad multimedio de resonancia cerrada, en la que debido a sus dimensiones y al material de alta conductividad del que están fabricadas sus paredes, se generan campos electromagnéticos de resonancia con una frecuencia comprendida en el rango de 2.425-2.475 GHz 1. Boon y Kok 1 recogen perfectamente la reciente historia del HMO en los laboratorios de patología que data sólo de hace dos décadas y que, a pesar de haberse obtenido numerosos progresos en la manipulación de las biopsias y de los procedimientos técnicos, tan sólo algunas de las posibilidades de este instrumento han sido adoptadas como cotidianas.
En el trabajo habitual de los laboratorios de patología existen diariamente múltiples actividades que pueden beneficiarse del empleo de HMO. La irradiación en los tejidos con una fuente energética externa de calor determina mejoras en la conservación de las características morfológicas e incremento de la velocidad de las reacciones fisicoquímicas que acontecen en el procesamiento de los tejidos 2.
La no universalización de los procedimientos técnicos empleando HMO creemos que tiene su principal causa en que en los laboratorios de patología fueron introducidos fundamentalmente los HMO domésticos. Estos presentan serios problemas a la hora de reproducir los resultados debido a la imposibilidad de controlar la temperatura adecuadamente (en muchos modelos la temperatura sólo se gradúa en múltiplos de 5 grados y en un rango limitado) o de controlar el tiempo de irradiación (unos modelos disponen de selección del tiempo en ciclos, en intervalos de tiempo predeterminados, etc.) y también debido a que existe una gran variabilidad en la potencia de cada MHO doméstico (rango entre 500-1000 W), por último es conocido que en la cámara del HMO no es homogénea la irradiación ni constante la temperatura que se alcanza. Todas estas circunstancias hacen imposible conocer la exacta potencia que se emplea en cada procedimiento y por ende su estandardización.
El desarrollo de procesadores microondas específicos para los laboratorios de patología ha permitido solventar los problemas en el control de potencia y temperatura manteniendo una curva de calentamiento ideal y manteniendo el tejido o las secciones histológicas en contacto con los reactivos durante el tiempo exacto a la temperatura o potencia deseada.
El propósito de esta comunicación es aportar nuestra experiencia en la utilización de los HMO de la última generación para el manejo de las biopsias que requieren un procesamiento acelerado y destacar distintos protocolos y procedimientos de fijación, inclusión y tinción de las muestras tisulares.
Las muestras fueron cilindros y cuñas renales con sospecha de rechazo agudo o procedentes de riñones de donantes añosos. Para el procesamiento de las biópsias empleamos un horno de microondas de última generación, específico para laboratorio, marca Energy Beam Sciences Inc. modelo H2800/2 con una potencia de 1800 vatios (Vitro-Imico, España).
Las muestras fueron procesadas en HMO según el protocolo de inclusión acelerada (aprox. 1 hora) que se detalla en la tabla I.
| REACTIVO | TIEMPO | TEMPERATURA | VOLUMEN REACTIVO |
|---|---|---|---|
| Preserve TM | 30 + 15 min. | T.A. + 55ºC | 250 mL en recipiente de plástico. |
| Alcohol absoluto | 4 min. | 67ºC | 250 mL |
| Alcohol absoluto | 2 min. | 67ºC | 250 mL |
| Alcohol isopropílico | 4 min. | 74ºC | 250 mL |
| Alcohol isopropílico | 2 min. | 74ºC | 250 mL |
| Parafina | 8 min. | 83ºC | 250 mL. Previamente calentada y licuada en horno convencional y en recipiente de cristal. |
* Para muestras de 4 x 3 mm de diámetro máximo. Para muestras más grandes o con tejido adiposo abundante hay que incrementar los tiempos
Tras obtener secciones renales de 3 µm de espesor, dejar secar en estufa durante 10 minutos y desparafinar e hidratar hasta agua destilada de forma convencional, se realizaron las técnicas histoquímicas de hematoxilina-eosina, PAS y tricrómico de Masson de forma clásica y también e HMO según los procedimientos siguientes:
Con los nuevos HMO se consiguen realizar los procedimientos técnicos habituales en los laboratorios de patología con igual o superior calidad que de forma tradicional. La figura 3 pone de manifiesto este hecho (Fig. 3). Se puede apreciar en las imágenes que la morfología y el grado de tinción de las estructuras renales son superponibles con ambos procedimientos. La aportación fundamental de los HMO para labortorio con respecto a los HMO domésticos es la posibilidad de controlar rigurosamente todo el proceso y hacer estandarizable los métodos entre los distintos laboratorios.
La fijación de los tejidos con HMO se produce de forma más rápida, y en el caso de biopsias como las utilizadas en este trabajo de 3-4 mm de espesor se completa en 45 minutos. Las muestras tisulares con este procedimiento son perfectamente válidas para realizar estudios complementarios de inmunohistoquímica o de biología molecular. Los fijadores empleados pueden ser como en este caso Preserve TM, Cryofix TM o formalina tamponada al 10%; todos ellos proporcionan unos resultados superponibles. El HMO puede utilizarse para fijar rápidamente con formalina tamponada secciones criostáticas. Este procedimiento consistente en aplicar sobre los cortes en congelación formalina tamponada al 10% irradiando en HMO a 450 W durante 20 segundos, la mejor calidad de las imagenes morfológicas puede ser de utilidad para el diagnóstico en las intraoperatorias.
La inclusión de los tejidos en HMO puede utilizarse en aquellos casos donde se requiere la emisión de un dictamen rápido. Como se desprende de esta comunicación, una de las principales aplicaciones son las biopsias de trasplante; pero biopsias de diagnóstico, principalmente de pequeño tamaño como son las biopsias endoscópicas o los cilindros renales, hepáticos, prostáticos etc., pueden beneficiarse de una inclusión menos prolongada. El principal factor que se debe considerar es el tiempo de contacto con los reactivos. Los tiempos de fijación e inclusión se de deben ajustar en función del tamaño del espécimen y de las características del tejido, principalmente la proporción de tejido adiposo. Nosotros preferimos modificar sólo el parámetro tiempo dejando constante el volumen de los reactivos y la temperatura de incubación.
Otros procedimientos que generalmente se alargan durante bastante tiempo, como la decalcificación de tejidos óseos o dentales pueden acelerase con el uso de HMO. Empleando HMO se pueden decalcificar las muestras para su posterior corte con micrótomo convencional en menos tiempo (horas o días en vez de en semanas). El procedimiento es muy simple y basta con colocar las muestras en una solución de ácido nítrico al 5%. e irradiar a 450 W hasta que el tejido se ablande. En el caso de cilindros de médula ósea puede conseguirse en menos de 4 minutos 5.
Las técnicas histoquímicas empleando HMO se pueden llevar a cabo de dos formas diferentes. Por un lado, se pueden realizar introduciendo las preparaciones en jarras Coplin con los reactivos en los que se introduce la sonda, que asegura el control exacto de la temperatura y del tiempo total en el que debe estar en contacto la sección tisular con el reactivo. Con esta forma de proceder, es aconsejable para mejorar las tinciones ajustar la temperatura de los reactivos por debajo de su punto de ebullición. De forma alternativa las tinciones se pueden realizar colocando sobre una plataforma de poliestireno los portaobjetos y cubriendo con algunas gotas del reactivo la sección tisular. En este segundo caso, la tinción es cuestión de segundos puede ser de utilidad en extensiones citológicas y cuando las altas temperaturas no produzcan alteración de los reactivos 6. Nosotros hemos obtenidos mejores resultados controlando la temperatura con sonda introducida en la jarra Coplin con suficiente reactivo y añadiendo dentro de la cámara del HMO un recipiente con agua destilada para garantizar un mayor grado de humedad.
Prácticamente todas las tinciones de histoquímicas habituales pueden realizarse empleando HMO (hematoxilina-eosina, Papanicolaou, Giemsa) como las tinciones histoquímica para identificación específica de sustancias, microorganismos o componentes tisulares (PAS, mucicarmin, Azul Alcian, Sudan, Perls, Rojo congo, Masson-Fontana, Grimelius, Ziehl-Neelsen, Plata metenamina, Auramina Rodamina, Van Gieson, Tricrómico de Masson, Bodian, etc.) 7 con una reducción de tiempo muy importante (de horas a minutos) y con una calidad semejante o mayor sobre todo en las técnicas en las que se emplean colorantes polares o colorante con iones de metales pesados que reaccionan extraordinariamente bien con la irradiación con HMO 7.
Es sin duda para el desenmascaramiento antigénico para lo que más se emplea el HMO. Diferentes son los procedimientos usados en cada centro en cuanto a tiempos, recipientes, soluciones tampón etc. tanta es la diversificación que ante la gran disparidad de resultados se intenta imponer la olla presurizada como método mas estandarizable para el desenmascaramiento antigénico. Nosotros pensamos que los nuevos HMO pueden ser de gran ayuda en la tarea de unificar procedimiento al poder controlar exactamente los parámetros mas cruciales como son temperatura y potencia de irradiación. Además en esto HMO La inclusión acelerada permite la realización de tinciones inmunohistoquímicas sin ningún tipo de artefacto e incluso mejora la tinción inespecifica debida a la biotina endógena presente en el riñón. En el caso de biopsias posttrasplante con sospecha de rechazo, el poder disponer en pocas horas de técnicas histoquímicas (hematoxilina-eosina, PAS y tricrómico de Masson) para poder establecer la severidad del rechazo renal mediante el sistema de puntuación de Banff, junto a un estudio completo del perfil inmunofenotípico por inmunohistoquímica del infiltrado inflamatorio, que facilita la identificación correcta de fenomenos como la tubulitis o la glomerulitis es de gran ayuda para el patólogo.
En conclusión, con estos breves comentarios queremos poner de manifiesto las múltiples posibilidades de los HMO específicos para laboratorios de Anatomía Patológica y las utilidades y beneficios que pueden tener en muchas de las actividades cotidianas que se llevan a cabo en nuestros laboratorios.
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Figura 3. Secciones tisulares renales fijadas e incluidas con el procedimiento convencional (A, B, C y D) y con procedimiento acelerado en horno de microondas (E, F, G y H). A y E, esclerosis glomerular y fibrosis intersticial (tricrómico de Masson x400). B y F, leve arteriosclerosis (B: PAS x400; F: H&E x400). C y G, glomérulos renales teñidos con PAS (x400). D y H, arteriolopatía hialina (PAS x400)
figura 3A |
Francisco O'Valle.
Copyright © 2000, Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina
y Hospital Universitario, Universidad de Granada, 18012 Granada, España. Reservados
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