| Comunicación Nº: 086 | English version  |
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Francisco O'Valle, Marco Masseroli, Francisco L. Mesa, Raimundo G. del Moral Jr. , Mariano Aguilar, David Aguilar, Raimundo G. del Moral
[Título] [Introducción] [Resultados] [Iconografía] [Discusión] [Bibliografía]
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Previa obtención por escrito de la conformidad con el estudio, fueron practicadas biopsias de mucosa oral interpapilar del sector gingival anterior a 20 sujetos sanos (media de edad 30±10 años), aprovechando la realización de una endodoncia en otra zona alejada. Igualmente se estudiaron 20 biopsias de encías con AG inducido por fármacos (CsA y nifedipino) procedentes de sujetos trasplantados renales (media de edad 38.5 ± 8 años), realizadas bien en el momento del diagnóstico o al practicarles la gingivectomía del sector anterior. Todos los pacientes trasplantados habían sido sometidos a tratamiento inmunosupresor con CsA a dosis de 8 mg/Kg/día y antihipertensivo con nifedipino a dosis de 40 mg/día al menos durante 12 meses. Los AG secundarios a este tratamiento combinado correspondieron a grado 3 (n= 5), grado 2 (n=7) grado 1 (n=8) según los criterios de Pernu (19).
Todas las muestras fueron fijadas en formalina tamponada al 10% durante 24 horas. En la prosección de la biopsia se tuvo en cuenta su orientación para cortar perpendicularmente a la superficie mucosa.
Las imágenes fueron captadas a partir de secciones histológicas de 4 micras de espesor, embebidas en parafina y coloreadas con la tinción de hematoxilina eosina para estudio histológico convencional y con la técnica de tricrómico de Masson para el estudio morfométrico.
Las técnicas inmunohistoquímicas fueron realizadas con el método de la estreptavidina -biotina-fosfatasa alcalina con los anticuerpos monoclonales CD45 (especificidad: todos los leucocitos), CD68 (especificidad: monocitos/macrofagos) y anti-EMA (para la identicicación de células plasmáticas) todas las diluciones a 1:50 (Master Diagnóstica, Granada, España). Las secciones después de desparafinarlas, se hidrataron y se realizó desenmascaramiento antigénico en horno microondas, los portaobjetos fueron colocados en un inmunoteñidor automático modelo TechMateTM 500 (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca). La incubación con el anticuerpo primario fue durantre 25 minutos a temperatura ambiente. La cuantificación del número de celulas inflamatoria presentes en la lámina propia se realizó sobre 10 campos seleccionados al azar y se valoró con la ayuda de una cuadrícula de 1 cm² dividida en 100 cuadrados de 1 mm² colocada en el ocular del microscopio.
La captación de las imágenes fue realizada a través de una videocámara color 3 CCD/RGB Sony, acoplada a un microscopio Olimpus BH-2, con el objetivo 10x, con el fin de incluir en la imagen la totalidad del espesor del epitelio y parte de la submucosa. Se obtuvieron por cada preparación histológica un número de imágenes variable (4 a 6) hasta evaluar la totalidad del epitelio de la biopsia, eliminando del estudio las zonas con artefactos de corte u orientación inadecuada.
Las imágenes fueron procesadas mediante ADI con la aplicación de análisis de imagen desarrollada en ambiente MS-WINDOWS en nuestro Servicio por uno de los autores de este trabajo (M.M.), cuyos principales pasos se describen en la Figura 1. Se trata de una aplicación informática creada con el software de desarrollo de programas de análisis de imagen Visilog 3.6 (Noesis, Francia) que permite el estudio automatizado de las secciones con sólo tres actuaciones interactivas:
1- Doble umbralización/segmentación de la imagen, empleando para ello los niveles de gris de la zona epitelial. 2- Unión de los vértices de las crestas epiteliales mediante el trazado de una polilínea (fig 2.1). 3- Trazado de una línea quebrada que atraviesa todas las crestas y papilas de la imagen.
El algoritmo implementado aisla automáticamente, mediante operaciones lógicas y de morfología matemática (20, 21) el área de epitelio y de submucosa. A continuación, utilizando la polilínea trazada entre los vértices de las crestas epiteliales identifica automáticamente las papilas submucosas presentes en la imagen y cuantifica todos los elementos extraídos.
Esta aplicación informática permite visualizar en pantalla los resultados de la elaboración junto a su cuantificación y exportar a un fichero ASCII todos los parámetros evaluados: 1- Área de epitelio en mm², su perímetro y espesor medio en mm (fig 2.2). 2- Área de submucosa en mm² (fig 2.4). 3- Área papilar en mm² (fig 2.3). 4- Número de crestas epiteliales en mm. 5- Número de papilas submucosas y su espesor medio en mm (fig 2.3).
Para valorar la fibrosis interstical empleamos la aplicación FIBROSIS HR (ver Comunicación "Com042" del Congreso virtual).
Los datos numéricos obtenidos fueron exportados a la base de
datos RSigma II (Horus, Harware, Barcelona) y procesados para
comprobar si las variables se ajustaban a una distribución
normal. Una vez comprobado, se aplicaron los tests estadísticos
de comparación de medias para muestras independientes (t de
Student), test de análisis de la varianza (Anova) y el test de
Mann-Whitney para las variables no paramétricas.
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