Comunicación
Nº 040
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Sofía Pérez, Agustín Rey, Pedro Lara, José Marín, Elena Redondo, Rosa Apolinario.
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SELECCIÓN DE PACIENTES
Nuestro estudio incluyó 92 pacientes afectos de carcinoma de células transicionales de la pelvis renal y uréter diagnosticados y tratados entre 1975 y 1993, en los que se disponía de cortes teñidos con hematoxilina- eosina y biopsia tumoral.
Eran 74 varones y 18 mujeres con una edad media de 64.95 +/- 9.47 años (rango 39-84). El estadiaje clínico y patológico de los tumores ha sido publicado previamente (Rey et al, 1997). Los tumores fueron estadiados de acuerdo a la clasificación TNM (Flemming et al 1997). El grado tumoral fue clasificado como describió Rosai et al, (Rosai et al 1990), por el sistema ASH modificado. Otras características tumorales estudiadas fueron la localización, patrón histológico, la invasión vascular y perineural. Todos los pacientes, fueron tratados mediante cirugía, la mayoría con procedimiento radical {89%} (Tabla 1)
Se perdieron tres pacientes en el seguimiento, poco después de la cirugía, y fueron eliminados del análisis de supervivencia.
INDICE APOPTÓTICO Y MITÓTICO
La determinación del índice apoptótico y mitótico se realizó en secciones tumorales con un grosor de 4 micras, fijadas en formalina y teñidas con hematoxilina- eosina. Diez campos fueron analizados en cada sección tumoral, con objetivo de alto poder {40x}, elegidos randomizadamente evitando las áreas de necrosis y de inflamación. Se contabilizó el número de células apoptóticas y mitóticas. Al menos 1000 células se contaron por cada tumor. Los criterios para definir apoptosis o cuerpo apoptótico han sido descritos previamente (Kerr et al 1972, Walker et al 1988). Células retraídas mostrando núcleo muy picnótico, con citoplasma alrededor intensamente eosinófilo o, cuerpos apoptóticos, visualizados como fragmentos cromatínicos, homogéneamente densos, generalmente redondeados, a veces con morfología crescéntica, superiores a 2 micras, intra o extracelulares, y rodeados o no de fragmento citoplásmico hipereosinófilo. Contabilizamos como uno, tanto a la célula apoptótica como el cuerpo apoptótico. Cuando observábamos varios cuerpos apoptóticos agrupados,contabilizabamos los mayores a 2 micras, y si estaban incluídos en un halo único los contabilizábamos como uno. Las mitosis fueron estimadas según los criterios de Baak et al (Baak et al 1985), ausencia de membrana nuclear, presencia de proyecciones “peludas” y citoplasma especialmente basófilo en lugar de eosinófilo. Deshechamos las figuras apoptóticas y mitóticas dudosas. El índice apoptótico (IA) y el índice mitótico (IM) fue definido como el cociente entre el número de figuras apoptóticas y mitóticas y el número de células contabilizadas en cada tumor, expresado como porcentaje.
INMUNOHISTOQUÍMICA
Nuestro protocolo ha sido descrito en detalle previamente (Rey et al 1997). El tejido embebido en parafina se cortó en secciones de 4 micras y se montó en cristales polisinados. Las secciones se deparafinizaron y rehidrataron. Se realizó la inmunotinción de la proteína p53 y Ki67 con anticuerpo prediluído (dilución del 1/100 en PBS) frente a la proteína p53, (clon BP53-12-1, Biogenex, California), o Ki67 (clon MIB-1, inmunotech, SA, Marsille) respectivamente. Como control positivo usamos tumor de pelvis renal que mostraba intensa positividad para p53 y Ki67. Como control negativo se procesó una sección de cada muestra omitiendo el primer anticuerpo. Se examinó la sección entera en busca de la región con la máxima proporción de núcleos teñidos. El porcentaje de núcleos teñidos fue determinado por contaje de 300 células, con un objetivo de 400x, en áreas de máxima expresión del marcador.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico de la comparación de medias de dos grupos se usó el test T de Student (o u de Mann-Withney si la distribución no era normal) y análisis de la varianza (test de ANOVA) para la comparación multigrupo. El test de Spearman se utilizó para la correlación de variables continuas. El método de Kapplan-Meier se usó para el análisis de la supervivencia (Kaplan and Meier, 1958) y el test de long rank para la comparación estadística de supervivencias en el análisis univariante (Peto et al 1977). El análisis multivariante se realizó usando el test de regresión de Cox por pasos (Cox 1972). Como fue reportado previamente (Rey et al, 1997) los puntos de corte para los índices del Ki67 y p53 fueron del 20 y 30% respectivamente.
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