Comunicación       Nº 046

Indice

Cuantificación de Ácidos Nucléicos Desarrollados en Gel de Agarosa. Diseño y Validación de un Método Simple de Análisis Digital de Imagen.

     Chat

[Introducción] [Material y Métodos] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

favargas@goliat.ugr.es

INTRODUCCIÓN: Las determinaciones moleculares se están imponiendo como técnicas complementarias en el diagnóstico y la investigación en patología. Para la identificación de los cambios en la expresión del mRNA se requiere el establecimiento de controles internos de calidad de la reacción, normalización de las muestras, así como de un adecuado método de cuantificación. Actualmente existen diferentes técnicas de las cuales la más utilizada es el desarrollo de muestras de ácidos nucléicos en geles de agarosa marcados con bromuro de etídio (BrEt). Debido a la diversidad de métodos existentes para la cuantificación de las bandas, su elevado coste y en algunos casos su complejidad o imprecisión, hemos diseñado un método simple basado en el análisis digital de imagen que permite realizar una cuantificación densitométrica de las bandas de ácidos nucléicos. Este trabajo describe el método de análisis de imagen diseñado y su validación.

MATERIAL Y MÉTODOS: Los algoritmos de procesamiento de imagen diseñados para la cuantificación de bandas de ácidos nucléicos desarrollados en geles de agarosa se implementaron utilizando el programa Visilog 4.0^â para el desarrollo de aplicaciones de análisis digital de imagen. Para la validación del método realizado se utilizó un gel de "estándar" marcado con BrEt y obtenido desarrollando diluciones seriadas conocidas de un producto de RT-PCR. Del gel colocado sobre un transiluminador de luz ultravioleta se capturó una imagen digital y se cuantificaron densitométricamente las bandas de ácidos nucléicos en la imagen mediante los algoritmos diseñados. De los valores de cuantificación obtenidos se valoraron sus relaciones con las cantidades de "estándar" realmente presentes en cada una de las bandas y se evaluó su replicabilidad analizando estadísticamente los resultados obtenidos en cuatro cuantificaciones sucesivas de la misma imagen del gel de "estándar".

RESULTADOS Y DISCUSIÓN: El método diseñado permite cuantificar densitométricamente las bandas de ácidos nucléicos desarrollados en geles de agarosa mediante captura de una imagen digital del gel y procesamiento de la imagen para la segmentación de las áreas de las bandas presentes. Los resultados de validación mostraron que los valores densitométricos cuantificados presentan una elevada correlación lineal (r=0.993) con las cantidades reales de "estándar" presentes en cada banda. El análisis de las proporciones entre cantidades de "estándar" y sus valores cuantificados de densidad óptica mostró que los errores de cuantificación son pequeños y las diferencias entre réplicas sucesivas no son significativas. Por lo tanto, el método desarrollado proporciona una cuantificación de bandas de ácidos nucléicos objetiva, fiable, precisa y reproducible.

CONCLUSIONES: El método automatizado de análisis de imagen ilustrado en este trabajo representa un simple instrumento de gran utilidad para la exacta y reproducible cuantificación de las bandas de ácidos nucléicos desarrollados en gel de agarosa.

Palabras claves: RT-PCR, Procesamiento de imagen, Cuantificación automática.

• Introducción
• Material y Métodos
• Resultados
• Discusión
• Iconografía
• Bibliografía

Francisco Arrebola, MS.
Copyright © 1996, Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Hospital Universitario, Universidad de Granada, 18012 Granada, España. Reservados todos los derechos.