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      Nº 046

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IndiceIndice

Cuantificación de Ácidos Nucléicos Desarrollados en Gel de Agarosa. Diseño y Validación de un Método Simple de Análisis Digital de Imagen.

Comentarios
[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Resultados

 

Procesamiento y Análisis de Imagen

Mediante los algoritmos implementados, inicialmente se invierte la escala de valores de gris de la imagen digital del gel a analizar, obteniendo su negativo. Seguidamente, la imagen negativo se normaliza expandiendo su histograma de valores de gris a toda la escala disponible (256 valores) y sobre esta imagen, entre las calles del gel en correspondencia de las bandas de elevada intensidad, se trazan líneas blancas (nivel de gris 0) de un pixel de ancho para impedir que las bandas resulten conectadas entre sí después del siguiente proceso de segmentación. La imagen así elaborada se umbraliza interactivamente para segmentar las bandas de ácidos nucléicos presentes en el gel y la imagen binaria obtenida se elabora automáticamente mediante operaciones lógicas y de morfología matemática para eliminar artefactos de umbralización e identificar separadamente cada banda12,13,14 (Fig. 1 B). Finalmente, sobre la imagen inicial invertida se cuantifican automáticamente el área (AREA) y densidad óptica media (DOM) de cada banda aislada, y se determina la densidad óptica media de "fondo" (DOMf) en una región del gel donde la fluorescencia existente es debida solamente a uniones inespecíficas del BrEt (Fig. 1 C). La cantidad de ácido nucléico presente en cada banda se determina considerando como parámetro la densidad óptica media integrada (DOMI) de cada banda, obtenida integrando sobre el área de la banda su DOM corregida (DOMC) de la DOMf (DOMC=DOM-DOMf), según la siguiente fórmula: DOMI=DOMC*AREA15.

 

Validación de los Resultados de Cuantificación

A continuación se detallan en las tablas 1, 2 y 3 los resultados de validación, obtenidos para cada uno de los parámetros de cuantificación considerados (DOMI, DOMC y AREA), según los dos métodos de segmentación de bandas evaluados.

En la figura 2 se presentan las distribuciones de los valores de DOMI, DOMC y AREA cuantificados sobre el gel de "estándar" según los dos métodos de segmentación de banda considerados.

.

Tabla 1. Análisis de los valores de densidad óptica media integrada (DOMI), cuantificados por análisis de imagen, según segmentación global de las bandas (MÉTODO 1) y segmentación individual de las bandas (MÉTODO 2).

 

DOMI - MÉTODO 1

DOMI - MÉTODO 2

ESTÁNDAR (mL)

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15

31.92

28.10

32.38

29.10

25.06

34.48

24.27

34.48

12

24.17

21.47

24.64

22.09

20.39

24.45

19.02

24.45

10

22.70

17.86

23.14

18.44

16.73

19.41

15.98

19.34

8

20.05

14.77

20.20

14.87

14.89

15.38

14.16

15.42

5

10.84

5.79

11.51

6.03

7.35

6.14

8.36

6.19

3

6.14

2.86

6.50

2.97

6.14

3.00

5.97

3.00

2

2.03

0.19

2.41

0.25

2.66

0.02

2.56

0.13

r

0.988

0.997

0.989

0.998

0.993

0.997

0.996

0.997

 

RATIO DOMI - MÉTODO 1

RATIO DOMI - MÉTODO 2

RATIO

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15/12

0.95

0.95

0.95

0.95

1.02

0.89

0.98

0.89

12/10

1.13

1.00

1.13

1.00

0.98

0.95

1.01

0.95

10/8

1.10

1.03

1.09

1.01

1.11

0.99

1.11

1.00

8/5

0.86

0.63

0.91

0.65

0.79

0.64

0.94

0.64

5/3

0.94

0.82

0.94

0.82

1.39

0.81

1.19

0.81

3/2

0.50

0.10

0.56

0.13

0.65

0.01

0.64

0.06

Media±s

0.91±0.23

0.76±0.35

0.93±0.20

0.76±0.34

0.99±0.25

0.72±0.37

0.98±0.19

0.72±0.35

CV (%)

24.98

46.91

21.80

44.59

25.99

51.33

19.09

47.80

sm

10.21

15.86

9.06

15.14

11.52

16.42

8.36

15.49

 

MÉTODO 1

MÉTODO 2

ANOVA DOS VÍAS

Media±s

CV (%)

Media±s

CV (%)

MÉTODO

REP

INTER

DOMI

15.12±10.23

67.66

13.91±9.89

71.10

NS

NS

NS

RATIO DOMI

0.84±0.28

33.33

0.85±0.31

36.47

NS

NS

NS

Media±s

0.84±0.09

10.71

0.85±0.15

17.65

CV (%)

34.57±13.01

37.63

36.05±15.92

44.16

sm

12.57±3.43

27.29

12.95±3.72

28.77

r

0.993±0.005

0.55

0.996±0.001

0.14

REP: replicación; RATIO: cociente entre las cantidades de estándar de dos bandas consecutivas; RATIO DOMI: producto entre el cociente de la cantidad de estándar de una banda (banda A) con la cantidad de estándar de la banda consecutiva (banda B) y el cociente del valor de DOMI de la banda B con el de la banda A; r: coeficiente de correlación lineal entre las cantidades de estándar y sus correspondientes valores de DOMI; CV: coeficiente de variación; sm: error estándar de la media; INTER: interacción entre método y replicación; NS: ANOVA no significativo.

 

.

Tabla 2. Análisis de los valores de densidad óptica media corregida (DOMC), cuantificados por análisis de imagen, según segmentación global de las bandas (MÉTODO 1) y segmentación individual de las bandas (MÉTODO 2).

DOMC - MÉTODO 1

DOMC - MÉTODO 2

ESTÁNDAR (mL)

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15

0.13

0.10

0.12

0.11

0.18

0.25

0.19

0.25

12

0.13

0.10

0.12

0.11

0.16

0.19

0.17

0.19

10

0.11

0.08

0.11

0.09

0.15

0.15

0.16

0.16

8

0.11

0.08

0.11

0.08

0.14

0.13

0.14

0.13

5

0.09

0.04

0.09

0.05

0.11

0.08

0.11

0.08

3

0.08

0.03

0.08

0.04

0.08

0.04

0.09

0.04

2

0.06

0.00

0.06

0.01

0.06

0.00

0.06

0.00

r

0.953

0.956

0.952

0.964

0.974

0.993

0.981

0.995

 

RATIO DOMC - MÉTODO 1

RATIO DOMC - MÉTODO 2

RATIO

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15/12

1.27

1.26

1.26

1.23

1.11

0.95

1.13

0.95

12/10

1.07

0.97

1.08

0.99

1.15

0.98

1.13

1.03

10/8

1.17

1.16

1.19

1.07

1.12

1.09

1.12

1.02

8/5

1.36

0.85

1.32

0.95

1.31

0.98

1.20

0.95

5/3

1.55

1.42

1.57

1.43

1.24

0.84

1.34

0.87

3/2

1.13

0.19

1.14

0.27

1.08

0.01

1.07

0.10

Media±s

1.26±0.18

0.97±0.43

1.26±0.17

0.99±0.39

1.17±0.09

0.81±0.40

1.16±0.10

0.82±0.36

CV (%)

14.02

44.39

13.57

39.79

7.66

49.11

8.18

43.39

sm

7.89

19.32

7.64

17.58

4.00

17.76

4.26

15.95

 

MÉTODO 1

MÉTODO 2

ANOVA DOS VÍAS

Media±s

CV (%)

Media±s

CV (%)

MÉTODO

REP

INTER

DOMC

0.08±0.03

37.50

0.12±0.06

50.00

p<0.001

NS

NS

RATIO DOMC

1.12±0.33

29.46

0.99±0.31

31.31

NS

p<0.001

NS

Media±s

1.12±0.16

14.29

0.99±0.21

21.21

CV (%)

27.94±16.45

58.86

27.09±22.26

82.16

sm

13.11±6.21

47.37

10.49±7.39

70.38

r

0.957±0.005

0.58

0.986±0.010

1.01

REP: replicación; RATIO: cociente entre las cantidades de estándar de dos bandas consecutivas; RATIO DOMC: producto entre el cociente de la cantidad de estándar de una banda (banda A) con la cantidad de estándar de la banda consecutiva (banda B) y el cociente del valor de DOMC de la banda B con el de la banda A; r: coeficiente de correlación lineal entre las cantidades de estándar y sus correspondientes valores de DOMC; CV: coeficiente de variación; sm: error estándar de la media; INTER: interacción entre método y replicación; NS: ANOVA no significativo.

 

.

Tabla 3. Análisis de los valores de área de banda (AREA), cuantificados por análisis de imagen, según segmentación global de las bandas (MÉTODO 1) y segmentación individual de las bandas (MÉTODO 2).

MÉTODO

AREA (pixel2) - MÉTODO 1

AREA (pixel2) - MÉTODO 2

ESTÁNDAR (m L)

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15

255

275

267

257

138

140

130

140

12

190

209

202

198

127

130

113

130

10

200

216

210

201

109

126

101

120

8

189

193

192

190

108

115

100

117

5

120

143

133

130

65

75

79

79

3

73

83

80

75

73

73

70

73

2

32

42

39

35

44

52

42

46

r

0.956

0.963

0.962

0.958

0.961

0.962

0.963

0.958

 

RATIO AREA - MÉTODO 1

RATIO AREA - MÉTODO 2

RATIO

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

1ª REP

2ª REP

3ª REP

4ª REP

15/12

0.93

0.95

0.95

0.96

1.15

1.16

1.09

1.16

12/10

1.26

1.24

1.25

1.22

1.03

1.16

1.07

1.11

10/8

1.18

1.12

1.14

1.18

1.24

1.14

1.24

1.22

8/5

1.02

1.19

1.11

1.09

0.96

1.04

1.26

1.08

5/3

1.01

0.97

1.00

0.96

1.87

1.62

1.48

1.54

3/2

0.66

0.76

0.73

0.70

0.90

1.07

0.90

0.95

Media±s

1.01±0.21

1.04±0.18

1.03±0.18

1.02±0.19

1.19±0.35

1.20±0.21

1.17±0.19

1.18±0.20

CV (%)

20.94

17.23

17.55

18.61

29.70

17.74

16.92

17.09

sm

9.46

7.99

8.08

8.49

15.84

9.52

8.87

8.98

 

MÉTODO 1

MÉTODO 2

ANOVA DOS VÍAS

Media±s

CV (%)

Media±s

CV (%)

MÉTODO

REP

INTER

AREA (pixel2)

159.19±76.29

42.92

95.71±31.50

32.44

p<0.001

NS

NS

RATIO AREA

1.02±0.18

17.65

1.19±0.23

19.63

p<0.05

NS

NS

Media±s

1.02±0.01

0.98

1.19±0.01

0.84

CV (%)

18.58±1.68

9.05

20.36±6.23

30.62

sm

8.50±0.68

7.95

10.80±3.37

31.20

r

0.960±0.003

0.32

0.961±0.002

0.22

REP: replicación; RATIO: cociente entre las cantidades de estándar de dos bandas consecutivas; RATIO AREA: producto entre el cociente de la cantidad de estándar de una banda (banda A) con la cantidad de estándar de la banda consecutiva (banda B) y el cociente del valor de AREA de la banda B con el de la banda A; r: coeficiente de correlación lineal entre las cantidades de estándar y sus correspondientes valores de AREA; CV: coeficiente de variación; sm: error estándar de la media; INTER: interacción entre método y replicación; NS: ANOVA no significativo.

  

[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Francisco Arrebola, MS.
Copyright © 1996, Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Hospital Universitario, Universidad de Granada, 18012 Granada, España. Reservados todos los derechos.