Comunicación
Nº 046

Cuantificación de Ácidos Nucléicos Desarrollados en Gel de Agarosa. Diseño y Validación de un Método Simple de Análisis Digital de Imagen.

[Título] [Introducción] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Material y Métodos

Gel de Agarosa de "Estándar"

El gel de "estándar" utilizado para validar nuestro método de cuantificación, estuvo constituido por bandas de ácidos nucléicos obtenidas a partir del producto de una reacción de transcripción de mRNA a cDNA seguida de una amplificación mediante reacción de en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Este producto de RT-PCR resultó de la transcripción y posterior amplificación de un mRNA, que codifica para la expresión de Endotelina-1 de rata y su tamaño es de unas 380bp^10,11. Del producto de RT-PCR se realizaron diluciones seriadas en microlitros, con tampón TE, que fueron desarrolladas en un gel de agarosa al 3% (mezcla 1:1 de agarosa de alto punto de fusión y agarosa de bajo punto de fusión), obteniendo las bandas de "estándar" a cuantificar. El desarrollo del gel se realizó en una cubeta de electroforesis estándar a 110 V/cm durante 45 min con tampón TBE 1X más BrEt 0.2 mg/mL.

Digitalización y Procesamiento de Imagen

Del gel a cuantificar colocado sobre un transiluminador de luz ultravioleta se captó una imagen digital mediante una videocámara Sony CCD-IRIS modelo SSC-M370CE con un objetivo Cosmical Televisión Lens de 8.5 mm FD 1:1.5. La imagen se digitalizó en una escala de 256 valores de gris (blanco y negro) poniendo el gel a una distancia focal de la cámara de 20 cm, obteniendo así un campo de 1950 mm² para una imagen de 189x84 pixel, lo que corresponde a una resolución espacial de 0.12 mm²/pixel (Fig. 1 A).

Los algoritmos de procesamiento y análisis de imagen diseñados para la cuantificación de bandas de ácidos nucléicos desarrollados en geles de agarosa se implementaron utilizando el programa Visilog 4.0^â (Noesis S.A.) para el desarrollo de aplicaciones de análisis de imagen, que funciona bajo MS-Windows (Microsoft Corporation) en cualquier ordenador PC.

Validación de los Resultados de Cuantificación

Para la validación del método de cuantificación, hemos tenido en cuenta los siguientes ítem: I) el parámetro definido que mejor cuantifica todas las cantidades de estándar presentes en las bandas; II) si el método interactivo de umbralización utilizado para segmentar las bandas de ácidos nucléicos influye en los resultados de cuantificación. Para esto se aplicaron dos procedimientos interactivos distintos para la segmentación de las bandas: en el primero se utilizó una umbralización global de la imagen (MÉTODO 1), mientras que en el segundo se aplicó una umbralización individual para cada banda (MÉTODO 2). Además se valoró la replicabilidad de los resultados de cuantificación repitiendo por cuadruplicado la cuantificación de la misma imagen del gel de "estándar" según cada uno de los dos métodos considerados.

De los parámetros medidos por análisis digital de imagen y para cada uno de los dos métodos, se analizaron estadísticamente todos los valores de cuantificación obtenidos y los productos entre el cociente de las cantidades de "estándar" de dos bandas consecutivas y el cociente inverso de los correspondientes valores cuantificados por análisis de imagen.

Para el análisis estadístico se evaluaron: la media, la desviación típica (s), el coeficiente de variabilidad (CV=100*s/media), el error estándar de la media (s_m) y el coeficiente de correlación lineal (r) de los valores obtenidos en cada réplica, y media, s, CV y s_mde sus proporciones. Además, se determinaron las medias, s y CV de los coeficientes anteriores para cada método, junto con el análisis de la varianza (ANOVA) de dos vías, con método y réplica como factores, para los valores cuantificados y sus proporciones.